rna干擾分化抑制因子

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1、RNA干擾分化抑制因子作者：曾達武，方明霞，劉豫瑞【摘要】目的研究針對分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)對人食管鱗狀細胞癌(ESCC)細胞增殖和凋亡影響的可能機制。方法陽離子脂質體法介導si-Id-1轉染ESCCTE-1細胞株，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化并計算轉染率，RT-PCR檢測Id-1的mRNA表達水平;免疫印跡法檢測Id-1的蛋白表達水平;細胞增殖實驗檢測轉染前后TE-1細胞增殖能力變化;流式細胞術檢測各組細胞的周期變化和凋亡指數(shù)。結果si-Id-1轉染前后的TE-1細胞株Id-1的mRNA

2、和蛋白表達水平有明顯差異(P<0.05);轉染后的TE-1細胞較其親代細胞增殖能力降低，凋亡程度增強(P<0.05);轉染后的TE-1細胞周期停滯在G0/G1期，G1期細胞數(shù)增多，S期細胞數(shù)減少(P<0.05)。結論利用脂質體將si-Id-1轉染至ESCC的TE-1細胞是切實可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1細胞Id-1的表達，從而抑制ESCC細胞增殖。【關鍵詞】抑制因子，免疫;癌，鱗狀細胞;食管腫瘤;RNA，小分子干擾;細胞凋亡;細胞增殖在我國，食管癌具有高發(fā)病率及高病死率，以手術為主輔以放

3、射治療或化學治療的綜合治療可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于轉移和局部復發(fā)[1]，因此尋求新的切實有效的食管癌治療方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitorofDNAbindingordifferentiation,Id-1)可在食管癌、肝癌等腫瘤中表達，參與腫瘤血管發(fā)生、促進腫瘤生長及轉移[2-4];而小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可有效沉默目標基因，而不影響正?；騕5]。該研究針對si-Id-1對人食管鱗狀細胞癌(ESCC)TE-1細胞增殖、凋亡、細胞周期的

4、影響，探討其對ESCC增殖和凋亡影響的可能機制?！　?材料與方法　　1.1主要試劑Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(廣州銳博生物公司)，人食管鱗狀細胞癌ESCCTE-1細胞(上海拜力生物公司，ATCC來源)，TrizolReagent(美國Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(美國Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗體、I1640培養(yǎng)液，于37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。以105mL-1的細胞密度接種培養(yǎng)，細胞80%融合后，用Lipo

5、fectamine2000轉染試劑進行轉染。3組siRNA均由廣州銳博生物公司設計與合成。　　Si-Id-1-001(19bp)：　　5'-UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT-3'　　3'-dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA-5'　　Si-Id-1-002(19bp)：　　5'-CAUGAACGGCUGUUACUCAdTdT-3'　　3'-dTdTGUACUUGCCGACAAUGAGU-5'　　Si-Id-1-003(19bp)：　　5'-GUUGGAGCUGAACUCGGAAdTdT-3'　　

6、3'-dTdTCAACCUCGACUUGAGCCUU-5'　　另外，本實驗還將標記FAM的siRNA同時轉染至TE-1細胞，分別于轉染6，24，48和60h后通過熒光倒置顯微鏡觀察含有熒光的細胞所占比例以及轉染前后的細胞形態(tài)變化，據此估計siRNA的轉染效率?！　?.3.2RT-PCR檢測Id-1的mRNA表達用Trizol一步法提取TE-1細胞總RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計測純度并定量。然后以mRNA為模板，Oligo(dT)18為引物，逆轉錄成cDNA，反應總體積為20μL，RT-PCR反應條件為

7、42℃孵育60min，70℃中止10min。Id-1的PCR反應引物由上海生物工程公司設計和合成，擴增片段大小為416bp?！　∩嫌我?Id1-P1)：　　5'-CAGCACGTCATCGACTACATCA-3'　　下游引物(Id1-P2)：　　5'-GAATCCCACCCCCTAAAGTCTC-3'　　以β-肌動蛋白(β-actin)的一段擴增序列為內對照，擴增片段大小為556bp。　　上游引物(β-actin-P1)：　　5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'　　下游引物(β-actin-P2)

8、：　　5'-TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC-3'　　反應體系：1×PCRBuffer，dNTP0.2mmol/L，cDNA模板200ng，引物濃度0.4μmol/L，Taq酶1.25U，反應總體積25μL。反應條件：94℃預變性5min;94℃30s→57℃30s→72℃45s，共30個循環(huán);72℃最后延伸7min。