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《體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)nod鼠ipscs分化為胰島素分泌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、f嘲燃碩士學(xué)位論文體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)NOD鼠iPSCs分化為胰島素分泌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究碩士研究生：余丹峰指導(dǎo)教師：蔡德鴻教授摘要研究背景l(fā)型糖尿病是一種體內(nèi)胰島素絕對(duì)缺乏所導(dǎo)致的以高血糖為特征的終身性疾病，其發(fā)病率正在以3-5％的速度逐年提耐¨。目前1型糖尿病患者在全球大約有2000萬，中國(guó)至少有100萬。1型糖尿病患者需終身胰島素治療以維持生命，目前尚沒有有效的手段根治1型糖尿病，不合理的胰島素補(bǔ)充所導(dǎo)致的高血糖或低血糖現(xiàn)象嚴(yán)重，以致各種并發(fā)癥接踵而至，患者壽命普遍縮短。為了有效控制血糖，防止糖尿病
2、并發(fā)癥的發(fā)生，提高糖尿病患者的生存質(zhì)量，替代被患者自身免疫系統(tǒng)破壞的胰島素分泌細(xì)胞，胰島細(xì)胞移植蓬勃興起【2’3】。而胰島細(xì)胞的移植仍面臨著兩大難題：一、供體來源不足，二、免疫抑制藥物的長(zhǎng)期使用。自體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)l主l于不存在倫理和免疫排斥限制【4】，有望成為誘導(dǎo)胰島素分泌細(xì)胞的種子細(xì)胞【31。但是iPSCs極低的誘導(dǎo)效率極大制約了其在臨床糖尿病治療中的應(yīng)用，如何安全高效地將自體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為iPSCs并誘導(dǎo)分化為有功能的胰島素分泌細(xì)胞成為制約這項(xiàng)技
3、術(shù)發(fā)展的難點(diǎn)。非肥胖型糖尿病小鼠(Thenonobesediabeticmouse，NODmouse)來源于ICR鼠，是Makion等【5】于1980年通過近親交配和選擇繁殖的一組具有白內(nèi)障傾向的自身免疫性糖尿病的動(dòng)物模型，病狀的特征為尿頻、多飲、高血糖、尿酸強(qiáng)陽性、摘要高膽固醇血癥，是目前人類研究l型糖尿病的良好動(dòng)物模型【61。本實(shí)驗(yàn)利用反轉(zhuǎn)錄病毒將3個(gè)干細(xì)胞基因Oct4、Sox2、Klf4導(dǎo)入NOD鼠尾成纖維細(xì)胞中，將其誘導(dǎo)為NOD．iPSCs，并對(duì)其干細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)及全能性進(jìn)行了分析鑒定。由于摒棄了原癌基因c．
4、Myc，高了安全性。采用可拆分的半透膜相隔離設(shè)計(jì)【7J——建立一個(gè)胰島細(xì)胞和iPSCs的共培養(yǎng)體系，在化學(xué)因子誘導(dǎo)分化【4J的基礎(chǔ)上，讓胰島細(xì)胞更為精確地模仿胰腺生存的微環(huán)境，分泌可溶性因子作用于iPSCs。研究體外胰島細(xì)胞共培養(yǎng)及化學(xué)因子聯(lián)合誘導(dǎo)是否具有更高的效率，并為之后胰島素分泌細(xì)胞的分離純化、功能檢測(cè)、移植實(shí)驗(yàn)提供便利，建立優(yōu)化的技術(shù)平臺(tái)。第一部分目的：1．利用三因子(Oct4、Sox2、Klf4)構(gòu)建NOD小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞系。2．對(duì)所獲得的iPSCs進(jìn)行鑒定及全能性分析，以期獲得與胚胎干細(xì)胞類似的多能干
5、細(xì)胞。方法：1．制備逆轉(zhuǎn)錄病毒：包含Oct4，Sox2和Klf4三個(gè)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒pMXs—Oct3、pMXs—Sox2、pMXs-Klf4及參照質(zhì)粒pMXs—EGFP購(gòu)自Addgene公司，使用DH5a細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后將4個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Plat．E，48h后收集病毒上清，過濾、濃縮后用于感染鼠尾成纖維細(xì)胞。2．分離與培養(yǎng)NOD鼠尾尖成纖維細(xì)胞(tail．tipfibroblasts，TTFs)：無菌分離成年的NOD鼠尾真皮，37。C下5％C02孵育5d，在這期間成纖維細(xì)胞從尾組織中遷移出來，
6、消化后接種至平皿培養(yǎng)。1．3代內(nèi)的細(xì)胞用于iPSCs的誘導(dǎo)。3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs及生成iPSCs：將收集的病毒上清感染生長(zhǎng)良好的TTFs，約1周時(shí)可首次看到iPS克隆，20d左右iPS克隆可長(zhǎng)至足夠大被挑取擴(kuò)大培養(yǎng)。4．鑒定iPSCs的生物學(xué)特性：通過鏡下觀察、堿性磷酸酶染色、反轉(zhuǎn)錄PCRTl碩士學(xué)位論文(RT．PCR)、免疫熒光實(shí)驗(yàn)及畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等對(duì)iPSCs形態(tài)、多能性基因表達(dá)情況、干細(xì)胞表面標(biāo)記及全能性等進(jìn)行鑒定分析。結(jié)果：1．制備逆轉(zhuǎn)錄病毒：逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Plat．E細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡下可見
7、綠色熒光表達(dá)(pMXs—EGFP)，轉(zhuǎn)染效率約在50—70％之問，細(xì)胞狀態(tài)良好。2．分離與培養(yǎng)NOD．TTFs：TTFs原代培養(yǎng)在接種后3．4h貼壁，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、多邊形或不規(guī)則形，中間1．2個(gè)圓形或卵圓形的核，原代TTFs雜細(xì)胞較多，隨著傳代次數(shù)的增多，其純度增高，一般第二代后即可得到較純的細(xì)胞。3．逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs及生成iPSCs：包含三個(gè)干細(xì)胞基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染TTFs后大約一周左右可以在鏡下首次看到iPS克隆，而后克隆繼續(xù)增殖，12d左右形成肉眼可見的iPS集落，16．20d時(shí)克隆長(zhǎng)至足夠大，此時(shí)進(jìn)行
8、挑取、消化、接種至飼細(xì)胞上傳代培養(yǎng)。4．鑒定NOD—iPSCs的生物學(xué)特性：從TTFs獲得的iPSCs鏡下觀察呈典型的克隆狀生長(zhǎng)，圓形或橢圓形，與飼細(xì)胞分界清楚；RT-PCR、堿性磷酸酶染色及免疫熒光檢測(cè)iPSCs高表達(dá)胚胎干細(xì)胞相關(guān)基因及蛋白；種植在免疫缺陷鼠體內(nèi)能夠形成向內(nèi)中外三個(gè)胚層分化的畸胎瘤，表明iPSCs具有多潛能性。未感染逆轉(zhuǎn)錄病
