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《豬胚胎干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、以科學(xué)發(fā)展現(xiàn)促進(jìn)科技創(chuàng)新(一)91豬胚胎干細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)研究況玲1馮書堂2牟玉蓮2劉嵐21．新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆烏魯木齊，830052；2．中國農(nóng)科院畜牧所，北京，100094摘要豬原始生殖細(xì)艟．(porcineprimordialgermcells，PGcs)具有干細(xì)胞的顯著特性，能在體外分化為神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和胚泡細(xì)胞。當(dāng)懸浮培養(yǎng)時(shí)豬EG細(xì)胞形成擬胚體，再經(jīng)維甲酸(RA)和=甲基亞礬(DMSO)誘導(dǎo)分化類桑椹胚體、類ES樣細(xì)胞集落、神經(jīng)樣細(xì)胞和滋養(yǎng)層樣細(xì)胞。關(guān)鍵詞豬胚胎干細(xì)胞分化雛甲酸二甲基亞砜胚胎干細(xì)胞(
2、embryonicstemcell，ES)是一種能在體外增殖，又能保持未分化狀態(tài)的細(xì)胞。在一定條件誘導(dǎo)下，可向多個(gè)方向分化，并生成多種功能性細(xì)胞。目前已經(jīng)從胚胎干細(xì)胞分化培育出了心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞、胰島細(xì)胞等(HubnerK，F(xiàn)uhrmannG。ChristensonL．K．etal，2003)。EG細(xì)胞的定向分化作為種子細(xì)胞，較以往用人或動(dòng)物的組織細(xì)胞作種子細(xì)胞好，數(shù)量大，生長快，取材容易。目前用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物ES細(xì)胞作核受體，用自身細(xì)胞作為供體，經(jīng)細(xì)胞核移植分離ES細(xì)胞，經(jīng)定向分化，用作克
3、隆治療，解央異俸移植的排異問題。對(duì)胚胎于細(xì)胞的研究具有廣闊的應(yīng)用前景，但也存在很多問題尚待解決。一、材料(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大白豬(中國農(nóng)科院畜牧所)，胎兒來自自然發(fā)情的性成熟的母豬。(二)主要試劑DMEM粉(Dutbeeco’sModifiedEagleMedium，[GIBCO])培養(yǎng)液；無Ca”、Mg”PBS緩沖液；胰酶一EDTA混合液(SIGMA)，絲裂酶紊C[MitomyeineC，(SIGMA)]，胎牛血清(FCS)(GIBCO)．新生牛血清(NBS)(杭州四季青生物工程材料有限公司)，干細(xì)胞生長因子[
4、stemcellfactor，rhSCF，(R&D)]；成纖維細(xì)胞生長因子[basicfibroblastgrowthfacmr，bFGF(R&D)]，青鏈霉裹(G1BCO)，非必須氨基酸(GIBCO)，p一巰基乙醇，L一谷氨酰胺(GIBCO)，0．1％明膠，維甲酸[Retinolcacid，RA，(SIGMA)]，二甲基亞砜(Dimethylsulphoxide，DMSO)。消化液：0．25％Trypsin一0．1％EDTA。無Ca”、M92+PBS液：NaCLlOg，Na2HPOs1．449，KCL0．2
5、59，KH2P030．259，加18．20純凈水到1000mL。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液：A液：5×106RA的EG培養(yǎng)液，B液：5×106RA+0．5‰DMSO的EG培養(yǎng)液，C液：05％DMSO的EG培養(yǎng)液。92．竺竺蘭蘭墾蘭堡蘭竺蘭竺蘭!±!!一：==E============={；4％===；=；====；===222；522；#2j=222；；_————————————————一一二、方法(一)胚胎的收集妊娠第26．5～29d宰殺母豬，從子宮中取胚胎。將所得胚胎用無Ca”、M92+PBS沖洗幾次，從胚胎中分離生
6、殖嵴，用無ca2+、M92+PBS反復(fù)沖洗幾遍。將生殖嵴在玻璃表面皿上研細(xì)，用細(xì)的吸管吹打，放入離心管沉淀10min后取上清液，反復(fù)沉淀2次，然后1000r]min離心lOmin，將沉淀細(xì)胞加胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基接種在新鮮的滋養(yǎng)層上，原始生殖細(xì)胞(primordialgermcells，PGCs)在38．5℃，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(z-)EG細(xì)胞的培養(yǎng)將收集的PGCs細(xì)胞分別接種于前一天制作的新鮮的STO細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，第二天觀察，換掉1／3的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。PGCs在培養(yǎng)的第二天就開始有EG細(xì)胞積聚出現(xiàn)，
7、到第三天和第四天開始出現(xiàn)大量的細(xì)胞聚集，并開始大量的有EG細(xì)胞集落出現(xiàn)，到第七天和第八天EG細(xì)胞集落出現(xiàn)達(dá)到高峰，這時(shí)可以傳代培養(yǎng)，每天需換液一次。(三)擬胚體的制備將豬胚胎生殖細(xì)胞(embryonicgermceil，EG)I書EG細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮或在只涂有明膠的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)3～4d擬胚體形成。(四)擬胚體的誘導(dǎo)分化當(dāng)出現(xiàn)擬胚體(EB)時(shí)，將擬胚體分為4組，移人涂有明膠的培養(yǎng)皿中，分別用A誘導(dǎo)液，B誘導(dǎo)液和C誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)。第四組為對(duì)照組。每天觀察2次，3～4d擬胚體貼壁生長并開始出現(xiàn)分化。三、結(jié)果豬E
8、G細(xì)胞以懸滴培養(yǎng)或在明膠鋪底的96孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)4～5d，形成擬胚體(圖1)，通過培養(yǎng)共收集到47個(gè)擬胚體。分為四組用不同的誘導(dǎo)劑做分化實(shí)驗(yàn)，A組10個(gè)使用誘導(dǎo)劑A液，B組11個(gè)使用B液，C組14個(gè)使用C液，D組12個(gè)為對(duì)照組。培養(yǎng)三天后，擬胚體擴(kuò)大出現(xiàn)胚胎狀。第四天后擬胚體逐漸開始出現(xiàn)貼壁，A組擬胚體貼壁生長，滋養(yǎng)層樣細(xì)胞(圖2)展開生長；B組5個(gè)分化發(fā)育為類桑椹胚狀(圖3)，2個(gè)分化為神經(jīng)樣細(xì)胞
