對紋狀體組織塊誘導胚胎干細胞定向分化探究研究

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1、對紋狀體組織塊誘導胚胎干細胞定向分化探究研究【摘要】目的：總結對紋狀體組織塊誘導胚胎干細胞定向分化的研究分析。方法：采用紋狀體組織塊與胚胎干細胞聯(lián)合培養(yǎng)的方法，以基礎培養(yǎng)基作為對照組；以基礎培養(yǎng)基+人胚胎紋狀體組織塊作為實驗組。在分化的第1、4、7、lid分別取出細胞爬片，經(jīng)酪氨酸軽化酶免疫細胞化學染色后對分化細胞進行鑒定。結果：酪氨酸務化酶免疫細胞化學染色細胞陽性率，對照組為0.54%,實驗組為7.48%,兩組比較有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)。結論：紋狀體組織塊能夠很好的誘導胚胎干細胞向多巴胺能神經(jīng)元方向分

2、化。【關鍵詞】紋狀體組織塊；誘導；胚胎干細胞；定向分化【中圖分類號】R321-3【文獻標識碼】B【文章編號】1004-4949(2012)08-0072-02胚胎干細胞是早期胚胎或原始性腺種分離出來的一種未分化的、具有多向分化潛能的細胞[1],它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新的特性，無論在體外還是體內環(huán)境，ES細胞都能被誘導分化為機體幾乎所有的細胞類型。隨著ES細胞的研究日益深入，生命科學家對人類ES細胞的了解邁入了一個新的階段。目前許多研究工作都是以小鼠ES細胞為研究對象展開的，如：德美醫(yī)學小組在去年成功的

3、向試驗鼠體內移植了由ES細胞培養(yǎng)出的神經(jīng)膠質細胞。而近期國內一些學者也已成功從人胚胎海馬組織中提取并培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，為進一步的干細胞分化移植研究積累了寶貴的經(jīng)驗［2］。本文采用紋狀體組織塊與胚胎干細胞聯(lián)合培養(yǎng)的方法，探索如何高效誘導胚胎干細胞分化為多巴胺能神經(jīng)元，取得了滿意效果，現(xiàn)報告如下：1材料和方法1.1一般材料1.1.1主要試劑與儀器：Neuralbasal即用型神經(jīng)細胞液體培養(yǎng)基（美國生命技術公司，批號F15971）；高糖、F12（Gibco公司，批號1459011）；B.疏基乙醇（Sigma公司，

4、批號05558311）；胎牛血清（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所，批號AB3101C190）；小牛血清（杭州四季青生物材料研究所）；絲裂霉素C（浙江海正，批號050812）重組人表皮生長因子（EGF,英國Peprotech公司）；白血病抑制因子（leukaemiainhibitoryfactor,LIF）（Sigma公司，批號064K1133）；酪氨酸務化酶（tyrosinehydroxylase,TH）單克隆抗體（SantaCruz公司）；人胚胎紋狀體組織塊（自備）。C02培養(yǎng)箱（美國SIM公司，E191TC

5、）；倒置顯微鏡（日本0lympus公司，CKX42）o1.1.2早期胚胎的收集與培養(yǎng)：分別取孕3.5、4.5d的母鼠，斷頸處死，在無菌條件下取出子宮；用ImL無菌注射器吸入沖胚液，從子宮角端進針，保證針頭進入子宮腔內，將沖胚液快速推入子宮腔；每側子宮注入沖胚液0.2—0.5mL,沖胚液會將胚胎沖出；將盛有胚胎和沖胚液的平皿置于40-100倍的倒置顯微鏡下；用移液器(上海大龍公司，0.2—10uL,YR23777)收集胚胎；最后以文獻[3]所示方法進行培養(yǎng)。1.1.3飼養(yǎng)層的制備：雌雄鼠合籠，于每天早上觀察陰道

6、栓，見栓當天上午定為懷孕的第0.5天；取孕12.5-14.5d母鼠，斷頸處死，無菌條件下取出胎鼠，去除頭部、尾部、內臟和四肢，用無菌眼科剪將軀干部剪成lmm3以下的碎塊，用向培養(yǎng)基中加入10g/ml的絲裂霉素C,作用2-3h,充分洗滌后，接種在涂有0.1%明膠的四孔板中。1.1.4ES細胞的分離培養(yǎng)：無菌條件下分離孕14d的昆明小鼠鼠中腦腹側腦組織，加入0.25%胰蛋白酶室溫消化20min,離心棄上清后加入含B27(20mg/mL)、EGF(20ng/mL)、bFGF(20ng/mL)、lOOu/mL青霉素和

7、100u/mL鏈霉素的DMEM/F12(1：1)無血清培養(yǎng)液，玻璃吸管輕柔吹打分散細胞，100目濾網(wǎng)過濾制成單細胞懸液。臺盼藍染色活細胞計數(shù)，調整細胞濃度為5X105個/mL,接種入25mL培養(yǎng)瓶內，每瓶量約5mL。培養(yǎng)瓶置入C02：恒溫培養(yǎng)箱(5%C02、95%02、37°C)內培養(yǎng)。每3、4天半量換液1次，培養(yǎng)7—10d后，選生長旺盛的ES細胞集落消化成單細胞懸液。1.1.5紋狀體組織塊的制備：在解剖鏡下取新生昆明小鼠的紋狀體，于無Ca2+、Mg2+Hanks液中反復沖洗去除血污，剝凈腦膜后，切成0.5m

8、m長、0.5rnin寬、0.5mm高的組織塊備用。1.2培養(yǎng)方法：實驗組：基礎培養(yǎng)基+人胚胎紋狀體組織提取液(50ml/L)o分化的第1、4、7、lid取出細胞爬片進行抗TH免疫細胞化學染色。對照組只加入基礎培養(yǎng)基,不加紋狀體組織塊，其他條件相同。每組3皿，重復3次實驗。1.3統(tǒng)計學處理：采用x2檢驗的精確概率檢驗法。2結果TH免疫細胞化學染色組別陽性率實驗組7.48%對照組0.54%【注】兩組比較