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《人參ago1基因克隆和序列研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人參AG01基因克隆和序列研究［摘要］目的：從人參葉片中克隆Argonaute1(PgAGOl)的全長基因，并利用生物信息學(xué)方法進行分析。方法：根據(jù)人參EST序列設(shè)計特異性引物，采用RACE方法克隆PgAGOl的cDNA全長，并對PgAGO1蛋白的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測、氨基酸序列多重比對以及構(gòu)建系統(tǒng)進化樹等分析；同時采用實時定量PCR檢測PgAGOl基因在人參不同組織根、莖、葉、花和愈傷中表達水平。結(jié)果：克隆的PgAGOl全長cDNA為3776bp,其中包括5’UTR204bp,3’UTR254bp,基因內(nèi)部包含完整的開放閱讀框，可編碼1105個氨基酸，預(yù)測蛋白
2、質(zhì)相對分子質(zhì)量為122.22kDa,理論等電點pl9.71；實時定量PCR檢測結(jié)果表明PgAGOl基因在人參花中的表達量最高，在根中最低。結(jié)論：從人參葉片中克隆得到PgAGOl的全長cDNA,為進一步研究該基因在人參組織發(fā)育中的調(diào)節(jié)作用打下基礎(chǔ)。［關(guān)鍵詞］人參；microRNA；Argonaute1；RACE；生物信息分析MicroRNA(miRNA)是真核細(xì)胞內(nèi)一類大小為20?24nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA,廣泛分布于動植物體內(nèi)，具有高度保守性［1-3］o在植物體內(nèi)，miRNA通過調(diào)節(jié)靶基因來控制植物根、莖、葉、花等的形態(tài)建成、細(xì)胞分化、疏導(dǎo)組織形
3、成以及植物對生物和非生物脅迫的響應(yīng)，在植物生長、發(fā)育和分化等過程中發(fā)揮非常重要的調(diào)控作用[2-6]o成熟的miRNA通過與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)結(jié)合，形成具有切割活性的RNA沉默復(fù)合物，再與靶基因互補配對來降解靶基因或抑制靶基因的翻譯[4,6-7]oAGO蛋白作為RISC的核心，在小RNA沉默通路中發(fā)揮關(guān)鍵作用。擬南芥AtAGOl是目前研究最為透徹的、功能也最為重要的一個AGO蛋白[8-9],參與miRNA、轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)、病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)或抗病毒沉默和ta-s
4、iRNA等多個通路。目前，有關(guān)AGO蛋白家族的功能和作用機制還未完全清楚，研究主要集中在擬南芥和水稻等幾種模式植物中，藥用植物人參AGO基因的研究未見報道。本研究以人參葉片為材料，對PgAGOl進行克隆，得到其cDNA全長序列3776bp；采用熒光實時定量PCR檢測PgAGOl基因在人參不同組織中的表達水平，為進一步研究該基因的作用機制奠定基礎(chǔ)。1材料ETC811東勝PCR擴增儀,CFX96BI0-RAD熒光定量PCR儀，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)等；大腸桿菌DH5a,TOP10及DNA快速凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；總RNA提取及RACE試
5、劑盒為Invitrogen產(chǎn)品；Poly(T)AdaptorRT-PCR試劑盒為Ambion產(chǎn)品；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD18-TVector,TaqDNA聚合酶、DNAMarker及實時定量PCR試劑盒購自大連寶生物工程公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純，實驗中所用的引物合成以及序列測定由北京三博遠(yuǎn)志公司完成。2方法2.1人參葉片的取材本實驗用于基因克隆的材料為石柱參PanaxginsengC.A.Meyercv.Shizhu,于2012年4月中旬購自遼寧省丹東市寬甸鎮(zhèn)石柱子村參場。經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所人工氣候室培育2周后對不同組織R
6、T(root根)，ST(stem莖)，LE(leaf葉)，F(xiàn)L(flower花)取材并迅速保存于液氮中。人參愈傷組織EC(embryogeniccallus胚性愈傷)的誘導(dǎo)與取樣見[11]o2.2PgAGOl基因的全長克隆采用Trizol方法抽提人參葉片總RNA?？俁NA的純化及DNaseI消化參照RNeasyPlantMiniKit(Qiagen)o用Oligotex試劑盒純化總RNA,獲得mRNA；根據(jù)InvitrogenGeneRacer試劑盒對mRNA進行去磷酸化、去帽子結(jié)構(gòu)、連接接頭；用SuperScriptIII(Invitrogen)試劑盒
7、進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。根據(jù)人參EST1(Genbank：gb
8、HS077398.1
9、)設(shè)計引物AGOR1,AG0R2,AG0F1；EST2(FW1NBNE01A7WLY)設(shè)計引物AG0R3,AG0F2；EST3(gb
10、DV555249.1
11、)設(shè)計引物AG0R4□AG0R1,AG0R2分別用于5’RACE的第一輪和第二輪；AG0F1,AG0R3用于擴增EST1和EST2中間未知序列；AG0F2,AG0R4用于擴增EST2和EST3中間未知序列；在AG0F2和AG0R4擴增出來的序列上設(shè)計引物AG0F3、AG0F4分別用于3,RACE的第一輪及第二
12、輪，引物序列見表輪程序：94°C2min；94°C循環(huán)；94°C45s,70°C
