h2s預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究

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1、第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究姓名：張卿卿申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：麻醉學(xué)指導(dǎo)教師：石學(xué)銀201205H2S預(yù)處理對肝臟缺血／再灌注損傷的保護作用及其機制研究摘要背景：肝臟缺血／再灌注損傷(HI／RI)是肝移植術(shù)、肝切除等需要阻斷肝臟血流的外科手術(shù)中常見的病理生理過程，嚴(yán)重影響手術(shù)效果和患者的預(yù)后。已有研究證明：氧自由基和活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)過量生成、能量代謝障礙、鈣超載、中性粒細胞浸潤和線粒體功能障礙等機制均參與了肝臟缺血／再灌注損傷的病理生理過程。硫化氫(H2S)是氣體信號分子家族一員，具有抗氧化、抗

2、炎癥和抗凋亡的作用。同時，H2S也是一種毒性氣體，是細胞色素氧化酶的強抑制劑，能抑制電子傳遞和氧的利用導(dǎo)致細胞內(nèi)缺氧。目前研究表明，H2S對肝臟I／R損傷具有保護作用，但其機制尚未完全明了。在肝臟FR損傷中，H2S是否通過保護線粒體功能發(fā)揮拮抗作用，尚有一定爭議性。本實驗用H2S的供體硫氫化鈉(NariS)預(yù)處理大鼠肝I／R損傷，通過組織學(xué)觀察、線粒體鈣容納力測定、線粒體凋亡通路相關(guān)蛋白檢測來研究H2S預(yù)處理對肝臟FR損傷的保護作用及可能機制。第一部分H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用通過組織學(xué)觀察和氧化還原指標(biāo)的測定明確H2S對肝臟I／R損傷。的保護作用。研究方法：采用大鼠肝臟7

3、0％缺血模型，夾閉肝臟左中葉脈管系統(tǒng)，形成肝臟中葉和左葉缺血，缺血lh／再灌注24h。將SpragueDawley(SD)大鼠隨機分成4組：假手術(shù)組(Sham組)：只打開腹腔，不給予夾閉缺血；缺血再灌注組(VR組)；物理性缺血預(yù)處理組(IPC組)：缺血1h前，給予一次短暫缺血(10min／次)，中間開放血管10minNariS預(yù)處理組(NariS組)：缺血前5min靜脈給予外源性H2S供體NariS。首先選取三個NariS濃度(11．tmol／kg，25t．tmol／kg，37．51．tmol／kg)，經(jīng)過組織學(xué)觀察，選出最適濃度。將各組肝臟組織進行HE染色和Tunel染色，光學(xué)顯微鏡下觀

4、察FR后肝臟組織損傷變化和凋亡水平，對各組大鼠肝臟損傷程度和凋亡率進行評分。取新鮮的肝臟組織立即進行谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測，觀察NariS預(yù)處理后肝臟組織中氧化指標(biāo)的變化。結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下觀察三個濃度的NariS預(yù)處理肝臟I／R損傷后的肝臟組織學(xué)變化，選取肝臟組織學(xué)損傷最小的Naris濃度——25“mol／I(g。觀察蘇木精．伊紅(hematoxylin．eosin，HE)染色結(jié)果，NariS組肝臟血竇區(qū)條索樣結(jié)構(gòu)保存相對完整，第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文組織中無或僅有少量氣球樣變性，而I／R組肝臟組織正常細胞邊界消失，可見大量細胞變性壞死，IPC組損傷程度介于FR組

5、和NariS組之間。與I／R組相比，NariS組Suzuki肝臟組織學(xué)評分顯著下降(1．667士0．52VS2．667+0．52，P<0．05)。Tunel染色結(jié)果顯示，與I／R組相比，NariS組凋亡率顯著下降(13．9％±0．045％VS38．6％±0．07％，P<0．05)。檢測GSH含量結(jié)果顯示，與I／R組相比，NariS組肝臟組織中GSH含量顯著升高(P<0．05)。結(jié)論：259mol／kgNariS預(yù)處理肝臟I／R損傷，肝臟損傷明顯減輕，細胞凋亡顯著下降，組織中GSH含量升高，提示H2S對肝臟1／R損傷的保護作用與其介導(dǎo)產(chǎn)生GSH，拮抗肝臟I／R后的氧化損傷有關(guān)。關(guān)鍵詞：缺血／

6、再灌注，硫化氫，GSH第二部分H2S預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護作用——線粒體機制研究實驗一線粒體分離鑒定及線粒體鈣容納力檢測鑒定差速離心法分離的線粒體純度，檢測大鼠肝臟I／R后肝臟組織中線粒體膜通透性。研究方法：SD大鼠隨機分為4組(處理方法同第一部分)。各組大鼠缺血1h再灌注24h后，取新鮮肝臟中葉用差速離心法制備線粒體。固定線粒體懸液，應(yīng)用透射電鏡觀察懸液中線粒體純度。下一步，應(yīng)用FlexStationII熒光檢測儀檢測各組大鼠線粒體的鈣容納力，計算線粒體鈣容納力(mitochondriacalciumcapacity，CRC)值，以此判斷線粒體的膜通透性。結(jié)果：經(jīng)投射電鏡鑒定，

7、差速離心法分離大鼠肝臟組織線粒體純度較高，形態(tài)基本正常，可以滿足下一步實驗的要求。經(jīng)過FlexStationII熒光檢測儀檢測的線粒體對外源性鈣脈沖的承受力后，可見，lmgNariS預(yù)處理組大鼠肝臟線粒體可以承受外源性鈣脈沖(101．tMCaCl2／min)約7次左右，而I／R組大鼠肝臟線粒體僅可承受34次左右。與I／R組相比，NariS組CRC值極顯著升高(198．63nmol／mg+24．86nmol／ragVS15