免疫復(fù)合物在prrsv-ade作用中的研究

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1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文免疫復(fù)合物在PRRSV--ADE作用中的研究姓名：張宜娜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：夏平安；崔保安201205中文摘要豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus，PRRSV)是能夠引起豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineReproductiveandRespiratorySyndrome。PRRS)的一種具有傳染性的病毒，該病毒主要造成仔豬呼吸障礙和母豬流產(chǎn)。PRRSV易變異，是單股正鏈RNA病毒，可引起豬

2、的持續(xù)性感染和免疫抑制，具有抗體依賴性增強(qiáng)作用(Antibody-dependentenhancement，ADE)，因此研究PRRSV的ADE作用感染機(jī)制對(duì)PRRS的防治具有重要意義。FcYR可分為激活型和抑制型兩種，而FclrRIIB是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的抑制型的受體，在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。本研究通過研究免疫復(fù)合物經(jīng)Fc3'R途徑增強(qiáng)PRRSV增殖作用，為進(jìn)一步深入研究免疫復(fù)合物對(duì)PRRSV-ADE的調(diào)節(jié)作用機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究以不同濃度非感染性免疫復(fù)合物分別處理豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM細(xì)胞)，

3、經(jīng)PRRSV感染48h后用已建立的PRRSVSYBRGreenI實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中病毒RNA。結(jié)果顯示，當(dāng)非感染性免疫復(fù)合物作4倍和8倍稀釋時(shí)，PRRSV的復(fù)制水平較病毒感染組略為升高，說明免疫復(fù)合物能經(jīng)FcTR以非劑量依賴性方式增強(qiáng)PRRSV復(fù)制。本試驗(yàn)用5倍稀釋鼠抗豬FcTRIIB抗體特異封閉PAM細(xì)胞表面Fc3,RIIB受體，經(jīng)不同濃度的非感染性免疫復(fù)合物與病毒的混合物感染PAM細(xì)胞48h后用同樣的方法檢測(cè)感染細(xì)胞中病毒RNA。結(jié)果顯示，2倍(2．635mg／mL)稀釋的免疫復(fù)合物在FeaRIIB

4、被封閉的情況下同樣能明顯的促進(jìn)病毒增殖，表明免疫復(fù)合物可通過激活型FeaR增強(qiáng)病毒復(fù)制。在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，又選擇4倍稀釋的免疫復(fù)合物(1．30mg／mL)分別于感染前、感染后、或與病毒同時(shí)來(lái)處理PAM細(xì)胞，感染12h、24h、36h和48h后用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中病毒RNA。結(jié)果顯示，非感染性免疫復(fù)合物在感染12，24和36h時(shí)間段內(nèi)均能明顯促進(jìn)病毒的增殖，但在48h后不顯著。說明免疫復(fù)合物在感染36小時(shí)內(nèi)促進(jìn)病增殖效果最強(qiáng)。本研究以4倍稀釋的免疫復(fù)合物處理PAM細(xì)胞，處理12h、24h、36h和48h后

5、用相對(duì)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)PAM細(xì)胞中IFN．a(chǎn)、IL．10和TNF．0【的mRNA水平，結(jié)果顯示，在處理24，36和48h時(shí)間段內(nèi)，免疫復(fù)合物均能降低IFN．0L和IL—10的mRNA水平，但和正常細(xì)胞相比沒有明顯差異，而TNF-a的mRNA水平較正常細(xì)胞略為升高。本試驗(yàn)以4倍稀釋的免疫復(fù)合物分別于感染前、感染后、或與病毒同時(shí)來(lái)處理PAM細(xì)胞，用相對(duì)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)PAM細(xì)胞中IFN一Ⅱ、IL．10和TNF噸的mRNA水平。結(jié)果顯示，在感染48h后，免疫復(fù)合物能明顯升高PRRSV誘導(dǎo)的IFN．a(chǎn)和T

6、NF．Q的mRNA水平，但在36h前沒有明顯規(guī)律，而在各時(shí)問段內(nèi)，均能降低IL一10的mRNA水平。說明免疫復(fù)合物經(jīng)FcTR調(diào)節(jié)PRRSV誘導(dǎo)的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄沒有明顯規(guī)律，這可能是因?yàn)槊庖邚?fù)合物同時(shí)能與激活型和抑制型FcTR結(jié)合造成的。本研究用5倍稀釋鼠抗豬腳RIIB抗體封閉PAM細(xì)胞，經(jīng)PRRSV感染12h、24h、36h和48h后用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)感染細(xì)胞中病毒RNA，同時(shí)用相對(duì)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)各組PAM細(xì)胞中IFN-a、IL一10和TNF-a的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染12和24h時(shí)間段內(nèi)

7、，封閉組中病毒復(fù)制水平略低于病毒感染組，但差異不顯著。而在感染36h時(shí)間段內(nèi)，病毒的復(fù)制水平明顯升高，但在48h時(shí)間段內(nèi)，病毒的增殖與病毒感染組相比變化不明顯。說明Fc丫RIIB的選擇性激活對(duì)PRRSV增殖的影響表現(xiàn)為先抑制后促進(jìn)。同時(shí)在病毒感染各時(shí)間段內(nèi)，封閉組中IFN-n和TNF．ⅡmRNA水平均高于病毒感染組，而IL一10的mRNA水平則明顯下降，且顯著低于病毒感染組。說明FeTRIIB的選擇性激活在PRRSV感染的免疫反應(yīng)中能增強(qiáng)抗病毒因子的水平。以上結(jié)果也說明PRRSV在細(xì)胞內(nèi)增殖可能并不完全與細(xì)胞內(nèi)抗病毒

8、因子的水平直接相關(guān)，這暗示PRRSV在PAM細(xì)胞內(nèi)復(fù)制存在更復(fù)雜的作用機(jī)制。關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；熒光定量PCR；非感染性免疫復(fù)合物；抗體依賴性增強(qiáng)作用；Fc／R：2THEEFFECTSoFIMMUNECoMPLEXoNADEoFPRRSVINFECTIoNSupervisor：Pro￡XiaPing’anMasterCandidat