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1、河南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文FcγRⅠ在PRRSV--ADE作用中的研究及LPS對(duì)PRRSV感染的影響姓名：周永輝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：夏平安201206河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生學(xué)位論文摘要豬繁殖與呼吸綜合征(PRltS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染引起的一種豬的病毒性傳染病。本試驗(yàn)通過(guò)研究IgG單體在PRRSV侵染PAM細(xì)胞的過(guò)程中的作用，為探討＆佩I在PRRSV感染中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。PRRSV感染后往往弓I起副豬嗜血桿菌等革蘭氏碉性細(xì)菌繼發(fā)感染，本試驗(yàn)初步研究了LPS對(duì)PRRSV
2、感染的影響，為更加深入的探討—惻Ⅳ與細(xì)藹混合感染的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本研究從健康豬肺收集PAM細(xì)胞，提取總RNA，設(shè)計(jì)一對(duì)F；cI峨I胞外區(qū)(除去信號(hào)肽)的特異性引物Fy。用RT-PCR方法擴(kuò)增出其基因片段，大小約為S22bp，將這基因片段亞克麈到pET-32a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-FY。在IPTG的誘導(dǎo)下成功表達(dá)，獲得了分子量大小約為47．2KD的重組蛋白FY，與預(yù)期的蛋白分子量相符：通過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件，大量表達(dá)重組蛋白，用尿素法對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行純化與復(fù)性。用純化蛋白免疫小鼠，制備抗重組蛋白FY的多克隆抗體，經(jīng)闊接EL
3、ISA檢測(cè)，效價(jià)為l：12800，并做免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果顯示制備的多抗可以與各自的重組蛋白特異性結(jié)合，表明表達(dá)的重組蛋白具有較好的免疫原性。本研究用純化的兔IgG(3．0mgmL)經(jīng)皮下免疫豬，每頭2．2mL，用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)血清中抗兔l掣G抗體效價(jià)，待抗體效價(jià)達(dá)到1：32時(shí)鼻腔接種PRRSV，接種后4d、6d，蜘、13d、17d、2∞、23d、26d，39d、47d、51d分別采集血液樣品制備血清，用熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)PRRS34病毒核酸，并用ELISA方法檢測(cè)抗腳llt．SV抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，免疫感染組豬感染后
4、4-39天均可在血清中檢測(cè)到PRRSV核酸，而接毒對(duì)照組則只在4-26d天檢測(cè)到病毒核酸，免疫感染組病毒血癥比感染對(duì)照組持續(xù)時(shí)問(wèn)延長(zhǎng)8天，且免疫感染組在4d、6d、9d、13d、17d，23d、26d、39d時(shí)PRRSVmRNA水平均較接毒對(duì)照組略微升高。免疫組血清ELISA抗體檢測(cè)在9d、13d、17d、23d均為PRRSV抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性抗體在體內(nèi)維持15天；接毒對(duì)照組廊-清ELISA抗體檢測(cè)在6d、蚰、13d、17d均為陽(yáng)性，陽(yáng)性抗體在體內(nèi)維持12天；其中在13d和17d時(shí)免疫組血清抗體效價(jià)較接毒對(duì)照組稍高，以上結(jié)果說(shuō)明豬·
5、。體內(nèi)珂cR：SV非特異性lgG
6、能促進(jìn)病毒感染。本研究通過(guò)先將終濃度為1．30mg／mL的PRRSV陰性健康豬lgG于37"(2處理刪I-M細(xì)胞12h后，再將100個(gè)TCIDso的PRRSV病毒液0．2mL接種PAM細(xì)胞，并設(shè)接毒對(duì)照組，通過(guò)熒光定量RT-PCR方法分別測(cè)定感染后12h、2411、36h、4811PRRSV拷貝數(shù)變化，結(jié)果顯示，PRRSV陰性健康豬IgG處理組PRRSV在各時(shí)間段拷貝數(shù)均較接毒對(duì)照組顯著提高，其中12h最高，拷貝數(shù)是對(duì)照組的11．7倍，48h最低，是對(duì)照組的3．5倍，說(shuō)明PRRSV非特異性豬lg
7、G經(jīng)FcyRl促進(jìn)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制。本試驗(yàn)通過(guò)將鼠抗豬腳RI胞外區(qū)重組蛋白多抗加入PAM細(xì)胞作用lh后接種PRRSV，分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h后，收集細(xì)胞及上清，同時(shí)鼠陰性血清加入PAM細(xì)胞作用lh后接種PRRSV作為對(duì)照，用real-timePCR方法檢測(cè)PAM細(xì)胞中病毒拷貝數(shù)，第1頁(yè)共59頁(yè)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生學(xué)位論文結(jié)果顯示，各時(shí)間段鼠抗豬聊RI胞外區(qū)重組蛋白多抗處理試驗(yàn)組PRRSV拷貝數(shù)與陰性血清處理組相比各時(shí)間段均增高，其中24h最高升高6．3倍。本研究通過(guò)將鼠抗豬Fc-／RI胞
8、外區(qū)重組蛋白多抗加入PAM細(xì)胞作用lh后分別培養(yǎng)12h、24h、36h、48h，．收集細(xì)胞及上清，同時(shí)做鼠陰性血清處理組和健康細(xì)胞對(duì)照組，用real-timePCR方法檢測(cè)PAM細(xì)胞中IFN-n、n旺噸、IL-10mRNA水平。結(jié)果顯示，特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清處理對(duì)照組相比12h、24h、36h、48hIFN．-(ImRNA水平均升高，其中12h最多升高3．9倍；特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清對(duì)照組相比，TNF-amRNA水平各時(shí)間段均升高，其中12h、24h顯著升高；特異性抗體處理試驗(yàn)組與陰性血清處理對(duì)照組相比，lL．
9、10mRNA轉(zhuǎn)錄水平各時(shí)間段均顯著降低。以上試驗(yàn)說(shuō)明PAM細(xì)胞內(nèi)激活F艱I能夠促進(jìn)IFN．-u、TNF噸mRNA的轉(zhuǎn)錄，而抑制IL．10mRNA轉(zhuǎn)錄，由此推測(cè)PRRSV感染前期通過(guò)FcYRI介導(dǎo)的PAM細(xì)胞吞噬作用促進(jìn)病毒增殖，后期抗病毒因子發(fā)揮抑制病毒增殖作用
