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1、遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化及聯(lián)合硫普羅寧移植治療小鼠急性肝損傷姓名:任飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:碩士專業(yè):藥理學(xué)指導(dǎo)教師:余麗梅201205遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化及聯(lián)合硫普羅寧移植治療小鼠急性肝損傷hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化及其聯(lián)合硫普羅寧移植治療急性肝損傷1第一部分共培養(yǎng)hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化體系建立與基因表達(dá)譜分析中文摘要目的:建立非接觸式共培養(yǎng)誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(humanamnioticmesenchymalstemceils,hAMSCs)分化為人肝樣細(xì)胞的培養(yǎng)體系,比較不同誘導(dǎo)體系與hA
2、MSCs誘導(dǎo)前后基因及蛋白表達(dá)的差異。方法:采用機(jī)械分離和二酶消化法培養(yǎng)hAMSCs,流式細(xì)胞儀術(shù)和免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定hAMSCs,非接觸式共培養(yǎng)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化,細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察,糖原、油紅染色及免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定肝樣細(xì)胞,ELISA法檢測(cè)白蛋白含量,基因芯片檢測(cè)各組細(xì)胞基因表達(dá)水平異同。結(jié)果:第3、4代hAMSCs表達(dá)CD44、CD29、CD73、CDl66和CD49d,高純度表達(dá)波形蛋白,基本不表達(dá)CD34和CD45。第4代hAMSCs與正常肝細(xì)胞系HL.7702非接觸式共培養(yǎng),HGF和bFGF.2誘導(dǎo)培養(yǎng)hAMSC
3、s,21d后,可見多角形細(xì)胞呈非典型的巢狀排列,糖原染色陽性,油紅染色可見較多脂滴存在,與未誘導(dǎo)hAMSCs比較,所誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞表達(dá)HNF一3B明顯增高,而CK.18改變不明顯,共培養(yǎng)誘導(dǎo)組肝樣細(xì)胞表達(dá)甲胎蛋白增加。hAMSCs和誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞,胞漿均表達(dá)白蛋白,但細(xì)胞培養(yǎng)液中未檢測(cè)到白蛋白。在10類88個(gè)基因的檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞與未誘導(dǎo)的hAMSCs之間存在13個(gè)基因的表達(dá)差異;共培養(yǎng)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞之間也存在12個(gè)基因的表達(dá)差異;未誘導(dǎo)的hAMSCs、共培養(yǎng)和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞均不表達(dá)WNT3A、NOTCHl、
4、TERT、ANPEP、NGFR和CCNA2六種基因。結(jié)論非接觸式共培養(yǎng)hAMSCs可成功誘導(dǎo)肝樣細(xì)胞;共培養(yǎng)和因子誘導(dǎo)的肝樣細(xì)胞與未誘導(dǎo)hAMSCs三者之間,存在著部分基因表達(dá)譜的差異,三者均不表達(dá)WNT3A、NOTCHl、TERT、ANPEP、NGFR和CCNA2六種基因。關(guān)鍵詞:共培養(yǎng);人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞;肝樣細(xì)胞;分化1課題來源:貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對(duì)象專項(xiàng)資編號(hào)編號(hào)黔科合人字(2009)27號(hào)、遵義市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目培育及人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目編號(hào)遵科培宇(2009)02號(hào)。.4遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文hAMSCs向肝樣細(xì)胞分化及聯(lián)合硫普
5、羅寧移植治療小鼠急性肝損傷PartOneThesystemestablishmentofco-culturedhAMSCsdifferatiationintoliver-likecellsandanalysisofgenesexpresslonproliting●l●一AbstractObjectiveToestablishtheCO—culturedwithoutcontactsystemofhumanamnioticmesenchymalstemcells(hAMSCs)differentiatedintoliver-likecells.C
6、omparedwiththelevelsofgeneandproteinindifferentinduceculturesystemsandhAMSCs.MethodsHAMSCswereisolatedfrombyenzymedigestionandmechanicalseparation.Culturedcellswereidentifiedbyflowcytometryandimmunocytochemistry.hAMSCsweredifferentiatedintoliver-likecellsbyCO—culturewithoutc
7、ontactandcytokineinduction.Themorphologychangewasobserved,periodicacid-Schiffreaction,oilredstainingandimmunocytochemistrywereusedtoidentifyliver-likecells.thelevelsofgeneandproteinweredetectedbygenechipsandELISAmethod.ResultsTheflowcytometryexaminationshowedtheexpressionsof
8、CD34,CD45,intheP3,P4generationcellswerenegative,butCD44,CD73,CD166andCD49dw