細(xì)胞及人胎肝CD34<'+>細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究姓名:劉革修申請學(xué)位級別:博士專業(yè):內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師:張洹2003.4.15小鼠胎肝Sca一1+細(xì)胞及人胎肝CD34+向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究摘">

小鼠胎肝Sca1細(xì)胞及人胎肝CD34細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究

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1、暨南大學(xué)博士學(xué)位論文小鼠胎肝Sca-1<'+>細(xì)胞及人胎肝CD34<'+>細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究姓名:劉革修申請學(xué)位級別:博士專業(yè):內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師:張洹2003.4.15小鼠胎肝Sca一1+細(xì)胞及人胎肝CD34+向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究摘要博士研究生劉革修導(dǎo)師張洹(研究員)目的:了解胎肝干細(xì)胞在體內(nèi)外是否具有向神經(jīng)組織細(xì)胞分化的潛能,即可塑性,以進(jìn)一步探索其分化規(guī)律;建立胎肝來源的細(xì)胞在體外向神經(jīng)組織細(xì)胞分化模型。擬從下面三個方面研究:小鼠胎肝Sea.1+細(xì)胞在體內(nèi)向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究;體外誘導(dǎo)小鼠胎肝Sea-1+細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究;體外誘導(dǎo)人胎肝CD34"細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化

2、研究。史?:1.觀察小鼠胎肝Sea.1+細(xì)胞移植后在受體鼠腦組織中的分化情況利用快速的PCR擴(kuò)增小鼠Y染色體特異的性別決定區(qū)蛋白基因(sexdetermingregionprotein,Sry)方法鑒定孕14.5dC57BL/6J胎鼠性別(總時間小于3,5h),免疫磁珠法分離雄性胎鼠肝的Sca-1+細(xì)胞,尾靜脈注射Sea.1+細(xì)胞(2.0x103個/,』、鼠)到致死劑量(10.0Gy)放射線照射的8-10周C578L/6J雌性小鼠(輻射后4h內(nèi)注射),然后將實驗小鼠飼養(yǎng)在無菌動物室。移植2、4、6月后斷髓處死小鼠,取材制作石蠟或者冰凍切片。將受體小鼠腦組織作免疫組化和FISH雙染色,以了解是

3、否有供體來源的細(xì)胞、是否具有神經(jīng)組織細(xì)胞表面標(biāo)志特點。移植后5、10、15、20、60、120天斷尾取血,作血象觀察和sty基因PCR擴(kuò)增,股骨骨髓切片作HE染色,以分析造血重建情況。2.體外誘導(dǎo)小鼠胚胎肝Sea.1+細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究采用免疫磁珠法分離孕14.5dC57BL/6J胎鼠肝的Sca.1+細(xì)胞,接種在10.cm塑料平皿或者培養(yǎng)瓶中(密度5×105cells/cm2),以DMEM/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種后第4d首次半量換液,以后隔天換液,細(xì)胞融合達(dá)80%,結(jié)束原代培養(yǎng),按1:3比例傳代。定期觀察,換液,傳代。第五代細(xì)胞以5,000/cm2接種在放置有經(jīng)10u

4、g/ml纖維粘連蛋白處理的蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM/F12+摘要10%胎牛血清。待細(xì)胞融合達(dá)80%后,用DMEM十10%胎牛血清+lmMp-ME十10—7MRA誘導(dǎo)24h,0.01MPBS(PH7.4)洗一遍。然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h一5d。期間相差顯微鏡下定時觀察形態(tài)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)分析細(xì)胞表型特點。半定量RT-PCR檢測神經(jīng)細(xì)胞特異基因表達(dá)(13-actin作內(nèi)對照),電泳凝膠在凝膠圖像分析儀檢測光密度,然后用SPSSl0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。3.體外誘導(dǎo)人胎肝CD34+細(xì)胞向神經(jīng)組織細(xì)胞分化研究細(xì)胞培養(yǎng):采用免疫磁珠法分離人胚胎肝CD34+細(xì)胞,接種在10一cm塑料

5、平皿或者培養(yǎng)瓶中(密度5×105cells/cm2),以DMEM/F12+10%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。接種后第4d首次半量換液,以后隔天換液,細(xì)胞融合達(dá)80%,結(jié)束原代培養(yǎng),按l:3比例傳代。定期觀察,換液,傳代。[1-ME+RA誘導(dǎo)分化:第五代細(xì)胞以5,000/em2接種在放置有經(jīng)10lag/ml纖維粘連蛋白處理的蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM/F12+10%胎牛血清。待細(xì)胞融合達(dá)80%后,用DMEM+10%胎牛血清+lmM13-ME+10’7MRA誘導(dǎo)24h,O.01MPBS(PH7.4)洗一遍。然后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h.5d。期間相差顯微鏡下定時觀察形態(tài)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)

6、分析細(xì)胞表型特點。RT-PCR檢測神經(jīng)細(xì)胞特異基因表達(dá)(3-actin作內(nèi)對照),電泳凝膠在凝膠圖像分析儀檢測光密度,然后用SPSSl0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。p—ME+BHA誘導(dǎo)分化:第五代細(xì)胞以5,000/cm2接種在放置有經(jīng)10lag/ml纖維粘連蛋白處理的無菌蓋玻片的六孔培養(yǎng)板中培養(yǎng),培養(yǎng)液為DMEM/F12+10%胎牛血清。待細(xì)胞融合達(dá)80%后,用DMEM/F12+10%胎牛血清+lmM[B-ME處理24小時;0.01MPBS(PH7.4)洗一遍;在DMEM/2%二甲基亞砜(DMSO)/0.2mMBHA/2mM13-ME無血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d。期間相差顯微鏡下定時觀察形態(tài)。采用免疫細(xì)

7、胞化學(xué)分析細(xì)胞表型特點。半定量RT-PCR檢測神經(jīng)細(xì)胞特異基因表達(dá)(B.a(chǎn)ctin作內(nèi)對照),電泳凝膠在凝膠圖像分析儀檢測光密度,然后用SPSSl0.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果:1.小鼠胎肝Sea-1+細(xì)胞具有向造血細(xì)胞和神經(jīng)組織細(xì)胞分化能力移植胎肝Sca-1+細(xì)胞的輻射實驗組小鼠外周血各種血細(xì)胞數(shù)在5天后開始下降,在10天后開始上升,20天恢復(fù)至正常,均存活6個月以上;而未移植Sca-1+摘要細(xì)胞的對照組小鼠20

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