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《小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及細(xì)胞移植對肝損傷作用的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、摘要小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及細(xì)胞移植對急性肝損傷作用的研究摘要肝臟是動物體內(nèi)最大的腺體，也是最重要的器官之一，肝臟的功能極為復(fù)雜，有體內(nèi)‘化學(xué)工廠’’之稱，所以肝臟一旦發(fā)病就嚴(yán)重威脅人類的身體健康，也是人類因疾病死亡的主要原因之一．目前人們對于各種原因?qū)е陆K末期肝病仍然沒有有效的治療措施，原位肝移植(orthotopiclivertransplantation，OLT)成為了疾病治療最后的保障，然而由于肝臟供體來源的短缺和可能發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的限制，肝移植的應(yīng)用比較局限。肝細(xì)胞移植技術(shù)(hepatoeytetmnSplmta
2、tion，HCT)是繼原位肝移植技術(shù)后又一種治療各種終末期危重肝病的方法，而且相對于OLT更具有優(yōu)勢，但同樣也面臨著細(xì)胞一來源的問題，而目前作為體外支持治療用的生物人工肝(bioartificialliver，BAL)也因為肝細(xì)胞來源問題而進(jìn)展緩慢，如何進(jìn)一步解決肝細(xì)胞的來源、數(shù)量和活力問題成為了開展HCT治療和BAL技術(shù)的核心問題。胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells．ES細(xì)一胞)具有無限增殖和三胚層多向分化的潛能，是再生醫(yī)學(xué)重要的種子細(xì)胞，為各種損傷及退行性疾病的細(xì)胞治療帶來了新的希望，建立有效的定向誘導(dǎo)分化技術(shù)用于損傷
3、和疾病組織的修復(fù)和替代治療研究是目前ES細(xì)胞研究的重要方向。研究表明ES細(xì)胞可一以在體內(nèi)外成功地分化為肝細(xì)胞，這對于各種終末期肝病的細(xì)胞治療提供了潛在無限的細(xì)胞來源，然而Es細(xì)胞誘導(dǎo)分化肝細(xì)胞的研究還處于初級階段，目前主要模擬肝臟發(fā)育的機制，通過相關(guān)細(xì)胞因子或化合物、基因修飾和共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為肝細(xì)胞，技術(shù)復(fù)雜、分化效率低下、成本高．本研究使用小鼠胚胎干細(xì)胞系ES．D3細(xì)胞作為研究對象，建立了兩步法單層誘導(dǎo)Es細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞的方法，并對誘導(dǎo)分化所得的肝樣細(xì)胞從形態(tài)學(xué)、基因表達(dá)、蛋白分子標(biāo)記及細(xì)胞功能等方面進(jìn)行了檢測，證明
4、了分化所得細(xì)胞為肝細(xì)胞，而且分化所得肝細(xì)胞脾臟移植到損傷小鼠肝臟后可以歸巢并整合到小鼠損傷肝組織內(nèi)；最后，利用建立的小鼠四氯化碳急性肝損傷模型，通過活體動物實驗檢測了人胎肝細(xì)胞系HL-7702作為生物人工肝細(xì)胞來源的潛力．本研究共分為六個部分，第一、二和三部分進(jìn)行了小鼠胚胎干細(xì)胞系ES．D3細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，并從細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)、蛋白分子標(biāo)記及細(xì)胞功能方面進(jìn)行了全面檢測，誘導(dǎo)分化所得細(xì)胞為肝樣細(xì)胞；同時對誘導(dǎo)分化過程中，丁酸鈉導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞及細(xì)胞移植對急性肝損傷作用的研究致的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象和細(xì)胞周期分布進(jìn)
5、行了研究，表明EGF可以抑制細(xì)胞凋亡．第四部分通過灌胃的方法，建立了小鼠急性四氯化碳肝損傷模型；第五部分將體外DAPI標(biāo)記的分化所得的ES．D3．Hep細(xì)胞通過脾臟注射的方法，移植到急性肝損傷小鼠體內(nèi)，表明移植的Es．D3．Hep細(xì)胞可以整合到損傷的肝組織內(nèi)．第六部分利用建立的小鼠急性四氯化碳肝損傷模型，過腹腔移植人胎肝細(xì)胞HL．7702，表明其作為生物人工肝的細(xì)胞來源具有潛在的價值．主要的研究結(jié)果如下：第一部分在小鼠ES．D3細(xì)胞的培養(yǎng)及定向誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察試驗中，以小鼠胚胎干細(xì)胞系mESC．D3為實驗材料，應(yīng)用KNOCK
6、OUT-DMEM和KNOCKOuT．sERL刀ⅥREPLACEM盼盯建立了小鼠Es細(xì)胞無血清培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合明膠鋪被，初步建立了小鼠ES細(xì)胞無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系，通過比較差速貼壁結(jié)合傳代和單純傳代對去除飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF的效果，結(jié)果表明，差速貼壁結(jié)合傳代去除飼養(yǎng)層細(xì)胞MEF的效果好于單純傳代，為Es細(xì)胞后續(xù)誘導(dǎo)分化奠定了基礎(chǔ)．同時，mESC．D3細(xì)胞通過兩階段單層誘導(dǎo)分化培養(yǎng)共19天，逐漸分化為肝樣細(xì)胞，光鏡和透射電鏡對分化細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)的觀察表明，分化所得細(xì)胞具有肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征．第二部分對Es．D3細(xì)胞誘導(dǎo)分化所得的
7、Es．D3．Hep細(xì)胞的一些標(biāo)志基因的表達(dá)進(jìn)行了檢測，同時對第一階段誘導(dǎo)分化過程中誘導(dǎo)分化劑丁酸鈉產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布進(jìn)行了檢測．結(jié)果表明，分化所得的Es．D3．Hep細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞具有的標(biāo)志基因AFP、ALB、’rnt和丸盯，而自發(fā)分化組細(xì)胞只是微弱表達(dá)AFP和ALB，不表達(dá)肝細(xì)胞晚期標(biāo)志物邢己和AA：r，提示誘導(dǎo)分化所得的ES．D3．Hep細(xì)胞已經(jīng)具備肝細(xì)胞具有的基因表達(dá)特征，包含不同成熟階段的肝細(xì)胞．誘導(dǎo)分化7天，NaB引起細(xì)胞凋亡使大量細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在S期，而通過添加EGF，可以明顯降低S期細(xì)胞周期的比例，增加Go／
8、Gl期細(xì)胞的比例，抑制細(xì)胞凋亡．第三部分對ES．D3細(xì)胞分化所得的ES．D3．Hep細(xì)胞進(jìn)行了相關(guān)重要標(biāo)志蛋白的免疫熒光分析，同時對其肝細(xì)胞功能進(jìn)行了鑒定．結(jié)果顯示，ES．D3．Hep細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)
