豬圓環(huán)病毒診斷及含cpg基序核酸疫苗對小鼠的免疫作用研究

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1、DiagnosisofporcinecircovirusandexperimentofDNAvaccinewRhCpG7一‘esissubmittedt01hesIsQngdaoAgriculturalUniversityInFulfillmemoftheRequiremeritfortheDegreeofMasterofAgronomYWuXiaoyan(DepartmentofPreventiveveterinary)Supervisor：WangJinbao，Qingdao．ChinaJune，2012獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研

2、究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：親鼢熱＼時間：■，>年莎月>b日，關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部

3、分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：蒙嘲迭、時間：v陋年∥月>召日導(dǎo)師簽名：時間：年月日豬圓環(huán)病毒診斷及含CpG基序核酸疫苗對小鼠的免疫作用研究摘要豬圓環(huán)病毒(Porcineeireovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科，是一種小的、無囊膜的單鏈負(fù)股環(huán)狀DNA病毒。圓環(huán)病毒共有2個基因型，分別為無致病性的PCVl和有致病性的PCV2。PCV2病毒粒子侵入機體后可引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致機體免疫力下降，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的威脅。針對PCV2的鑒定和檢測已有許多方法，如ELISA、IFA、PCR等，但是這些方法過程繁瑣、耗時較長或者人為操作誤差較

4、大。而熒光定量PCR：．JL術(shù)具有快速、靈敏、高特異性等特點，因此被越來越多的應(yīng)用于各種病毒的檢測。本研究利用普通PcR技術(shù)擴增PCV2的ORF2基因702bp片段，并克隆到pVAXl載體，以純化的質(zhì)粒作為PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)模板，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，摸索熒光定量PCR試驗，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此建立一種熒光定量PCrt#爭異性檢測豬圓環(huán)病毒的方法。結(jié)果表明，該方法對PCV2有很好的特異性，其敏感性比常柵CR高100倍，批間與批內(nèi)重復(fù)試驗變異系數(shù)均小于2．5％。經(jīng)臨床應(yīng)用表明熒光定量PCR方法的建立實現(xiàn)了對PCV2特異性的快速診斷乖定量檢測。在利用豬腎臟細(xì)胞

5、(PK．15)培養(yǎng)PCV：病毒中很容易污染無致病性的PCVl，給PCV2的純化與培養(yǎng)帶來困難。本研究還建立了一種多重?zé)晒舛縋CI凇測技術(shù)以快速區(qū)分PCVl和PCV2。本研究設(shè)計了3條引物，其中D1是PCVl和PCV2共享引物。結(jié)果表明，PCVl和PCV2擴增產(chǎn)物的熔解溫度(Tm)分別為84．5±O．20℃和86．6±0．03℃，可以根據(jù)熔解峰的不同來區(qū)分。反應(yīng)的靈敏度分別可達(dá)到1×101拷貝旭和1×102拷貝地，且與PRV、PRRSV和PPv無交叉反應(yīng)．此方法為監(jiān)控細(xì)胞毒的純化培養(yǎng)提供了簡便快捷的方法。為了研究含CpG基序的核酸疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫作用，將40只6

6、周齡Balb／c小鼠隨機分為四組，其中：A組是PBS對照組，B組是pVAXl空載體組，C組是pVAXl。ORF2疫苗組，D組是18CpG-pVAXl．ORF2．疫苗組。各組均采用肌肉注射，每次200rtL，疫苗有效成分含量1001．tg，2周后按相同途徑和劑量進(jìn)行第二次免疫，二免后4周用0．2mL的PCV2SD株細(xì)胞培養(yǎng)物(106一TCID50／“)接種小鼠，檢測抗體變化情況并進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。試驗結(jié)果表明，注射疫苗后各組小鼠沒有明顯癥狀，攻毒后A、B組小鼠呈現(xiàn)微觀剖檢病變，疫苗組無病變。核酸疫苗pVAXl．ORF2和18CpG-pVAXl．ORF2均有一定的免疫

7、刺激作用，但18CpG-pVAXl．ORF2組在免疫后抗體水平明顯升高，而且二免后2周S／P值達(dá)到最高值0．4340，抗體水平下降緩慢，攻毒后抗體水平迅速升高，且作用持久。攻毒后熒光定量PCR結(jié)果顯示小鼠臟器中出現(xiàn)病毒復(fù)制，但是疫苗組能夠逐漸清除病毒。因此含有18個CpG的核酸疫苗在小鼠身上起到較好免疫保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：熒光定量PCR；鑒別診斷；CpG基序；核酸疫苗n●·—■●-●111·』Dla星mosisolDorcmeCIFCovIrusann哪enmentofDNAvacc'mewithCpGmotifsinmicePorcineeircovirus6,