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1、鄭州大學碩士學位論文SmosiRNA對裸鼠食管癌移植瘤細胞凋亡影響的研究姓名：張虎申請學位級別：碩士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：張紅；陳奎生201205摘要SmosiRNA對裸鼠食管癌移植瘤細胞凋亡影響的研究碩士研究生：張虎導師：張紅教授陳奎生教授鄭州大學基礎醫(yī)學院病理學教研室河南省腫瘤病理重點實驗室河南鄭州450052摘要在消化系統(tǒng)腫瘤中，食管癌是常見惡性腫瘤之一，對人類的健康和生命造成了極大的威脅。其具有發(fā)病率高及發(fā)病隱匿、轉(zhuǎn)移和死亡率高等特點。目前臨床上用于食管癌治療的方法主要是外科手術(shù)治療、化療、放療以及綜合治療，盡管近年來各種治療方
2、法得以不斷改進和完善，但食管癌患者的預后仍然較差，為提高食管癌的療效和改善患者的生存質(zhì)量，尋求一種新的治療方法是當前食管癌治療的研究熱點。Smoothened(Smo)基因是由3772bp構(gòu)成的DNA序列，基因定位于染色體7q32．3。Smo蛋白是由Smo基因編碼的一條具有1024個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。Smo蛋白在Hedgehog(m)信號通路中充當著信號轉(zhuǎn)換器的作用，它可以將來自細胞外的Hh信號轉(zhuǎn)換為細胞內(nèi)可識別的特異性轉(zhuǎn)錄因子Glil信號，進而作用于下游靶基因Ptch、Wm、Bmps等。當細胞間質(zhì)中有Hh配體存在時，Smo蛋白擺脫了Ptch
3、受體的束縛，此時的Smo蛋白將向微管復合體上Fu和Cos2提供磷酸基團促使Glil從復合體上脫離，此時的Gli蛋白轉(zhuǎn)化成催化劑形式并以全長的形式進入細胞核啟動下游基因轉(zhuǎn)錄。Glil基因定位于染色體12q13．2．q13．3，其與Gli2、Gli3均有5個保守的鋅指結(jié)構(gòu)，鋅指間由組氨酸與半胱氨酸連接。Glil基因編碼的產(chǎn)物Glil蛋白是特異性轉(zhuǎn)錄因子，可將胞質(zhì)內(nèi)信號傳遞到細胞核，啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄，Gli基因摘要家族與果蠅Ci基因是同源基因，它們編碼的蛋白質(zhì)在Hh信號通路中起到關鍵作用。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)指雙鏈RN
4、A(double．strandedRNA，dsRNA)在胞質(zhì)中Dicer酶(一種核酶)的作用下，以一種ATP依賴的方式逐步將外來的雙鏈RNA(dsRNA)切割成特定長度的小干擾RNA(siRNA)，長度一般為2Int．23nt，siRNA再與體內(nèi)的內(nèi)切酶、外切酶和解旋酶等共同組成可被RNA誘導的沉默復合物(RNA—inducedsilencingcomplex，PdSC)，然后RISC激活ATP酶依賴的siRNA解雙鏈過程。外源性、內(nèi)源性基因編碼的mRNA與激活后的RISC在同源區(qū)域特異性的結(jié)合，在RISC的核酸酶功能的作用下，對其mRNA與siR
5、NA中反義鏈互補結(jié)合部的3端和5端切割，切割位點間的mRNA迅速被降解?，F(xiàn)已證實Smo基因的高表達與多種腫瘤的發(fā)生有關，如：胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和基底細胞癌等。近期本實驗室相關研究結(jié)果顯示，Smo、Gli蛋白及mRNA在食管鱗癌細胞中高表達；Smo高表達與食管鱗癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關；SmosiRNA可抑制食管鱗癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。可見Smo與食管癌的發(fā)生發(fā)展有關。本研究采用不同濃度SmosiRNA轉(zhuǎn)染食管癌EC9706細胞，篩選出對Smo表達抑制效應最強的SmosiRNA序列、濃度和作用時間后，構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型，即將
6、濃度為250ng／}tl的SmosiRNA．1轉(zhuǎn)染食管癌細胞72h后收集細胞，調(diào)節(jié)濃度為1x107／ml，以裸小鼠背部肩胛旁區(qū)作為注射點，分別皮下注射0．2ml。采用免疫組織化學及Westemblot技術(shù)檢測各組瘤組織中Smo及Glil蛋白的表達；采用組織原位雜交及RT-PCR技術(shù)檢測各組瘤組織中Smo及GlilmRNA的表達；采用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，采用透射電鏡對凋亡細胞的超微結(jié)構(gòu)進行觀察，為分子靶向治療食管癌提供實驗基礎和理論依據(jù)。材料和方法1．人食管癌EC9706細胞株來自于中國醫(yī)學科學院分子腫瘤學國家重點實驗室惠贈；Balb／c裸
7、鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司。2．分組轉(zhuǎn)染：設24h、48h和72h三個轉(zhuǎn)染時間段，每個時間段均設150ng／I_tl、200ng／I-tl和250ng／I_tl三個轉(zhuǎn)染劑量，將特異性siRNA．1、siRAN．2及siRAN．3分Ⅱ摘要別轉(zhuǎn)染EC9706細胞，結(jié)果顯示250ng／I_tl、siRNA．1和72h組抑制效應最強，并將此組細胞構(gòu)建為裸鼠食管癌移植瘤實驗組。3．裸鼠食管癌移植瘤模型構(gòu)建：將裸鼠分為3組，每組5只分別為：siRNA干擾組、無關序列組和空白對照組，以肩胛下為注射點，分組皮下注射各組細胞，構(gòu)建裸鼠食管癌移植瘤模型。4．采用
8、免疫組織化學及Westernblot方法檢測各組瘤組織Smo及Glil蛋白的表達情況。5．采用組織原位雜交及RT．PCR技
