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《（果樹學專業(yè)論文）柑橘cbf類似基因的克隆與分析》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、華中農業(yè)人學碩十學位論文柑橘CBF類似基因的克隆與分析摘要柑橘是亞熱帶水果，在栽培范圍上受到低溫的限制。周期性凍害往往導致柑橘果實產量降低、品質下降，甚至樹體死亡，從而造成巨大的經濟損失。因此，防治凍害就成為柑橘產業(yè)發(fā)展和提高其經濟效益的一個重要問題。解決這一問題的主要方法途徑是加強Ffl問管理和選育抗寒新品種，而后者是根本途徑。近年來，采用基因工程手段培育新品種已成為農作物育種的一種趨勢。植物抗寒性屬于復雜的數量性狀，是多基因協同作用的結果。采用單一基因轉化植物，雖能在一定程度上提高轉基因植物對低溫的抗
2、性，但實際效果往往不理想。CBF是調控一系列植物冷馴化相關基因表達的一種轉錄因子，在低溫誘導下迅速合成，與相應順式作用元件CRT／DRE結合，促進基因的轉錄，進而合成糖類、脯氨酸和膜蛋白等物質，提高植物的抗寒性。基因轉化試驗證明，CBF基因在擬南芥和油菜等多種植物中超量表達，轉基因植株對低溫的耐性均顯著增強。這一發(fā)現為利用基因工程手段提高植物耐寒性提供了一條新途徑。本研究從抗凍性明顯不同的枳殼、臍橙和檸檬中分離出CBF同源基因的AP2核心區(qū)段，初步確證了柑橘中同樣存在CBF介導的冷馴化過程。進一步從枳殼這
3、一抗寒性最強的柑橘種類中克隆出CBF基因的全長cDNA，并進行全面的生物信息學分析，為今后利用這些基因提高柑橘抗寒性奠定基礎。主要的試驗結果如下：1．探索柑橘葉片總RNA提取方法，先后嘗試了異硫氰酸胍法、Trizol試劑法和熱酚法，最終確定采用熱酚法，并用LiCl沉淀的方法從柑橘葉片中提取的RNA最完整，DNA、蛋白質和多糖等雜質含量最少。2．參考擬南芥等其它物種中CBF蛋白的保守區(qū)域設計了四條簡并引物，并篩選出最優(yōu)的一對引物，用于RT．PCR擴增。結果從枳殼、臍橙和檸檬中各分離出一個CBF同源基因AP2
4、核心區(qū)段(柑橘CBFa基因)。并從枳殼中分離出另一個不同的CBF基因AP2核心區(qū)段(枳殼CBFl基因)。利用BLAST比對分析發(fā)現，這四個CBF片段與其它物種CBF蛋白間具有很高的同源性。臍橙和檸檬CBFa基因AP2區(qū)段的序列完全一樣，而與枳殼CBFa基因AP2區(qū)段存在數個核苷酸位點的差異和一個氨基酸殘基的差異。3．依據所分離的兩個枳殼CBF基因AP2區(qū)段的核苷酸序列，設計分別指向5’和3’端的嵌套特異引物，參考SMARTRACE技術，采用巢式PCR分別擴增枳殼CBFa和CBFl基因的5’和3’端。測序驗
5、證后，在5'-UTR和3'-UTR區(qū)設計引物，PCR擴增獲得全長基因，或者采用酶切拼接法獲得全長基因。結果成功獲得了枳殼CBFa和CBFl基囚的全長cDNA。柑橘CBF類似桀I矧的克隆‘j分析4．利用GeneBank、ExPASy、EMBOSS和Jalview等數據庫和軟件對所克隆的兩個枳殼CBF基因全長cDNA進行全面的生物信息學分析，結果發(fā)現枳殼CBFa和CBFl基因都具有CBF特征序列、核定位信號序列、保守的AP2DNA結合結構域和潛在的酸性結構域。這是所有物種CBF因子的典型結構特征。此外，它們還
6、具有一些其它的特征位點，包括酰基化、酪胺酸硫化和Amidation位點以及一些蛋白激酶磷酸化位點，如蛋白激酶C磷酸化位點和酪蛋白激酶II磷酸化位點等。推測這些特征位點可能與翻譯后加工、活性調節(jié)和正常功能的行使有關。關鍵詞：柑橘；冷馴化；CBF；全長cDNA；基因克??；生物信息學2華中農業(yè)人學碩．1：學位論文CloningandAnalysisofCBF--likeGenesfromCitrusAbstractAsasubtropicalfruit，citrusisrestrainedbylowtemper
7、atureonitsculturalarea．Naturalrecurrentlowtemperatureofteninducesdecreaseoffruitproductivity，declineoffruitquality，andevencausesdeathoftree，allofwhichmaydecreaseeconomicandecologicalprofitgreatly．So，avoidingorprotectingcitrusfromlow-temperaturedamageisani
8、mportantproblemonenlargingtheculturalareaandincreasingtheprofitofcitrusproduction．Mainmeasuresonsolvingthisproblemareimprovingfieldmanagement，selectingorcultivatingnovelvarietieswithhightolerancetolowtemperature．Atp
