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《dhv-ⅰ單克隆抗體的制備與膠體金試紙條的研制》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、3．11單抗的純化與鑒定????????????????3．12膠體金標(biāo)記抗體最低穩(wěn)定量的測(cè)定?????????3．13金標(biāo)抗體吸附于玻璃纖維?????????????3．14NC膜包被單抗和二抗???????????????3．15樣品墊的選擇??????????????????3．16最適標(biāo)記金顆粒大小的選擇????????????3．17免疫層析試紙條性能的測(cè)試????????????4討論????????????????????????4．1DHv_IVPI的表達(dá)????????????????4．2小鼠的免疫????????????
2、???????????574．3建立篩選方法??????????????????????584．4細(xì)胞融合????????????????????????584．5陽性克隆的篩選?????????????????????604．6腹水的制備???????????????????????604．7單克隆抗體的純化?????????????????????604．8蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH?????????????????614．9NC膜的選擇???????????????????????614．10膠體金顆粒大小的選擇?????????????
3、?????614．11試紙條的假陽性問題???????????????????625結(jié)論·?···?··??????··?····?”“”???”一?”““”””””·636參考文獻(xiàn)?????????????????????????647致{射??????????????”?????“??????”73IV符號(hào)說明山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV,duckhepatitisvirus)引起的主要發(fā)生于3周齡以下雛鴨的一種傳播迅速、致死率高的傳染病(Woolcock,P．R．eta1．2003)。本課題對(duì)DHV
4、-I病毒結(jié)構(gòu)蛋白VPl進(jìn)行了原核表達(dá)，制備了抗DHV-I的單克隆抗體，研制了檢測(cè)DHV-I的膠體金試紙條。通過RT-PCR方法擴(kuò)增DITV-IVPl基因片段，并定向克隆到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌Rosetta(DE3)PLys中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到大小為47KD的融合蛋白；Westernblot分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白能與抗DHV-I陽性血清進(jìn)行反應(yīng)，具有良好的免疫學(xué)活性。用純化的DHV-I病毒作為抗原免疫BALB／C小鼠并建立了間接ELISA篩選方法。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)確定了間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株
5、的最佳反應(yīng)條件，即純化的抗原以1：800稀釋，4℃包被過夜，以1：4000稀釋陰、陽性血清分別作為陰陽性對(duì)照，反應(yīng)條件以37℃90min為最佳，酶標(biāo)二抗的工作濃度為l：1000稀釋。取免疫小鼠脾臟與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，以建立的間接ELISA篩選方法對(duì)融合的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)篩選，經(jīng)過初檢、二檢、三檢共獲得陽性雜交瘤細(xì)胞株21株，利用有限稀釋法進(jìn)行了3．4次亞克隆(其中最少有兩次為單克隆)后獲得5株能穩(wěn)定分泌McAb的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1E10、4F8、4E6、5G4、5Ell。對(duì)這5株雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性、染色體數(shù)、亞類、腹水效價(jià)、特異
6、性進(jìn)行了鑒定，結(jié)果如下：經(jīng)連續(xù)傳代20次和凍存后4個(gè)月復(fù)蘇檢測(cè)，其分泌抗體的能力差異不顯著，穩(wěn)定性好；染色體數(shù)介于100～110之間，具有典型的雜交瘤細(xì)胞染色體特征；經(jīng)亞類鑒定，1E10、4F8、4E6、5G4、5Ell雜交瘤分泌的抗體類型分別為IgG2b、IgM、IgGl、IgM、IgGl；單抗腹DI-IV-I單克隆抗體的制備與膠體金試紙條的研制水效價(jià)分別為1：400，1：8000，1：8000，l：32000，1：16000；并具有很好的特異性。通過硫酸銨沉淀法對(duì)腹水單克隆抗體進(jìn)行純化并測(cè)定了其蛋白含量；在確定標(biāo)記單克隆抗體最低穩(wěn)定量后，
7、成功制備了金標(biāo)單克隆抗體；經(jīng)反復(fù)摸索確定了NC膜最佳包被單克隆抗體的量為lmg／mL，羊抗鼠最佳包被濃度為1：10稀釋，同時(shí)兩者按照1IXL／cm噴膜；選擇Ahlstrom8964和GRADE7589分別作為金標(biāo)墊和樣品墊制備膠體金試紙條。分別用樣品稀釋液和病毒液作為陰陽性對(duì)照檢測(cè)試紙條，結(jié)果陰性對(duì)照只出現(xiàn)質(zhì)控線而病毒稀釋液出現(xiàn)檢測(cè)線和質(zhì)控線。臨床檢測(cè)結(jié)果表明該膠體金試紙條特異、敏感，可用于DHV-I的快速診斷。關(guān)鍵詞：DHV、原核表達(dá)、單克隆抗體、膠體金、免疫層析試紙條2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractDuckhepatitisis
8、akindofhighlycontagiousandlethalinfectiousdiseasewhichcausedbyduckhepatitisvirus．D
