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《新型低溫蛋白酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、萬方數(shù)據(jù)分類號(hào)：Q815密級：(秘密、機(jī)密、絕密)學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號(hào)：11812508新型低溫蛋白酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究Genecloning，expressionandcharacterizationofnovelcold-adaptedproteases專業(yè)名稱：指導(dǎo)教師姓名：研究生姓名：申請學(xué)位級別：論文提交日期：論文課題來源：學(xué)位授予單位：微生物與生化藥學(xué)(理)路福平教授莫清珊理學(xué)碩士2014年5月自選天津科技大學(xué)萬方數(shù)據(jù)天津科技大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明晰Y惝2m7㈣5㈣5㈣10m3礬本人
2、鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包括任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果內(nèi)容，也不包括為獲得天津科技大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。對采文研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名：翩塒日期：Ⅻf牛年鄉(xiāng)月日知識(shí)產(chǎn)權(quán)和專利權(quán)保護(hù)聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師具體指導(dǎo)下并得到相關(guān)研究經(jīng)費(fèi)支持下完成的，其數(shù)據(jù)和研究成果歸屬于導(dǎo)師和作者本人，知識(shí)產(chǎn)權(quán)單位
3、屬天津科技大學(xué)；所涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權(quán)及使用權(quán)完全歸天津科技大學(xué)所有。本人保證畢業(yè)后，以本論文數(shù)據(jù)和資料發(fā)表論文或使用論文工作成果時(shí)署名第一單位仍然為天津科技大學(xué)。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。作者簽名：日期：珈f缸年舌月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，同意公布論文的全部或部分內(nèi)容，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)天津科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、
4、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密ll(請?jiān)诜娇騼?nèi)打“√”)，在年解密后適用本授權(quán)書。作者導(dǎo)師年月日年月曰萬方數(shù)據(jù)摘要低溫蛋白酶是指最適催化溫度在40℃以下的一類蛋白水解酶，一般由嗜低溫微生物或耐低溫微生物產(chǎn)生。由于其最適催化溫度接近自然環(huán)境中的溫度，因此在應(yīng)用過程中可省去加熱和冷卻過程，與中高溫蛋白酶相比具有節(jié)能、省時(shí)等特點(diǎn)。本研究旨在從嗜低溫微生物中篩選新型低溫蛋白酶，研究分析其酶學(xué)性質(zhì)，并對編碼基因進(jìn)行克隆與表達(dá)方面的研究。具體研究工作包括如下4個(gè)方面：(1)從南印度洋的深海沉積物中分離到一株嗜低
5、溫動(dòng)性球菌(Planococcussp．11815)，該菌株可以在0．4℃之間進(jìn)行正常的生長代謝，并在20℃以下具有表達(dá)分泌低溫蛋白酶的能力，經(jīng)48h搖瓶發(fā)酵，蛋白酶產(chǎn)量可達(dá)280U／mL。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示：該菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH值為8．0，最適作用溫度為37℃，當(dāng)催化溫度降至30℃時(shí)，酶活可保持在80％以上，并且在4℃條件下仍具有水解蛋白的能力。因此該菌株所產(chǎn)蛋白酶屬于典型的低溫堿性蛋白酶，具有一定的研究及開發(fā)價(jià)值。(2)通過設(shè)計(jì)簡并性引物并采用反向PCR的方式從篩選獲得的嗜低溫動(dòng)性球菌中分別克隆到兩
6、種蛋白酶編碼基因：cpls8和cpls41，序列分析結(jié)果顯示：cpls8所編碼的蛋白屬于絲氨酸蛋白酶中的S8家族，是一種胞內(nèi)蛋白酶；而cpls41所編碼蛋白屬于$41家族，是一種分泌型蛋白酶。Blast比對結(jié)果顯示：cpls8與cpls41基因所編碼蛋白與目前數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的蛋白酶序列的最高同源性分別為72％和76％，因此可確定為新型編碼基因。(3)將cpls8基因克隆至表達(dá)型載體pET-22b上，并在大腸桿菌Rosseta(DE3)中實(shí)現(xiàn)了功能表達(dá)。重組蛋白酶CPLS8經(jīng)分離純化后，比酶活可達(dá)到32．68U／mg
7、，其最適作用溫度為37℃，最適pH為10．0，在45℃保溫60min，則酶活完全喪失。Ca+對該酶起促進(jìn)作用，而EDTA等離子鰲合劑以及PMSF則對該酶有抑制作用。(4)將cpls41的編碼基因分別克隆至融合表達(dá)載體pET-32a上，在E．coliRossetaDE3中實(shí)現(xiàn)了CPLS41的融合表達(dá)。經(jīng)蛋白分離純化、腸激酶處理去除融合蛋白后，CPLS41極不穩(wěn)定，完全降解；進(jìn)一步嘗試將該基因在枯草芽孢桿菌WB600中進(jìn)行分泌表達(dá)，未獲成功。關(guān)鍵詞：動(dòng)性球菌；低溫蛋白酶；重組酶；異源表達(dá)；酶學(xué)特性萬方數(shù)據(jù)ABSTRAC
8、TThecold．a(chǎn)daptedproteasesarecharacterizedbylowoptimalcatalytictemperatures(below40。C)，whichweregenerallyproducedbypsychrophilicorpsychrotolerantmicroorgnisms．Basedontheirhighcataly
