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《豬帶絳蟲組織蛋白酶b基因的克隆、表達(dá)及功能研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、密級：論文編號：中囯農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué)位論文豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因的克隆、表達(dá)及功能研究Cloning,ExpressionandCharacterizationofCathepsinBfromTaeniasolium碩士研宄生.?孫銘苑指導(dǎo)教師：才學(xué)鵬研宄員申請學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)：?獸醫(yī)學(xué)研宄方向：魂培養(yǎng)單位：蘭州獸醫(yī)研究所研究生院2015年5月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationCloning,ExpressionandCharacte
2、rizationofCathepsinBfromTaeniasoliumMS.Candidate：SunMingyuanSupervisor：ProfessorCaiXuepengMajor：PreventiveVeterinaryMedicineSpecialty:AnimalVaccinesandMolecularImmunologyMay2015摘要豬囊尾蚴能夠引起豬和人的囊蟲病，影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類的健康。組織蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶家族成員，在寄生蟲的營養(yǎng)、生長發(fā)育、組織遷移、蛋白加工和活化以及免疫逃避等方面
3、發(fā)揮重要作用，是預(yù)防及治療多種寄生蟲疾病的潛在的藥物靶標(biāo)和疫苗候選分子。本文對豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能的初步研究。取得了以下結(jié)果：1.以豬帶絳蟲的cDNA為模板，成功地擴(kuò)增了豬帶絳蟲組織蛋白酶B基因（TscpB）。利用生物信息學(xué)工具，對該序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明該基因ORF大小為1074bp，編碼357個氨基酸，理論分子質(zhì)量為39.27ku，具有組織蛋白酶B的特征結(jié)構(gòu)域。Real-timePCR結(jié)果表明，組織蛋白酶B基因在成蟲期表達(dá)量顯著高于囊尾蚴時期。2.構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a-Tscp
4、B，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了以包涵體形式存在的重組蛋白rTscpB，分子大小約為38ku。Westernblotting分析表明，rTscpB能被豬囊尾蚴病陽性血清特異性識別。用純化后的rTscpB免疫家兔，4次免疫后產(chǎn)生了特異性的高滴度IgG抗體。免疫組化結(jié)果表明，rTscpB主要表達(dá)于成蟲的體壁及生殖器官，證明豬帶絳蟲組織蛋白酶B可能與蟲體攝取營養(yǎng)以及生殖發(fā)育有關(guān)。3.構(gòu)建了畢赤酵母真核表達(dá)重組質(zhì)粒pPIC9K-TscpB。明膠酶譜實(shí)驗證明yTscpB具有水解活性，且能夠降解熒光底物Z-Phe-Arg-AMC，最適pH為5
5、.5。yTscpB還能降解豬IgG、BSA、纖連蛋白等大分子。yTscpB的水解活性能被E-64特異性抑制。底物實(shí)驗表明豬帶絳蟲組織蛋白酶B可能在攝取營養(yǎng)、入侵宿主等方面發(fā)揮作用。4.利用同源模建的方法預(yù)測了豬帶絳蟲組織蛋白酶B蛋白的結(jié)構(gòu)，利用分子對接的方法預(yù)測了組織蛋白酶B蛋白與抑制劑E-64之間相互作用的模式。關(guān)鍵詞：豬帶絳蟲，組織蛋白酶B，免疫定位，酶活力，同源模建IIIAbstractTaeniasoliummetacestodes,thatcancausecysticercosisinpigsandhumans
6、,seriouslyaffecttheproductionofpigsandthehealthofhumanbeings.CathepsinBisoneoftheimprotantmembersofcysteineproteases.ItwasprovedbymanypreviousstudiesthatcathepsinBhadavarietyoffunctionsinparasitepathogenicityandfacilitatedparasiteevasionfromhostimmuneresponses,es
7、sentialnutrientuptakeandtissuepenetration,whichcontributestheenzymeapromisingtargetforchemotherapyorimmunoprophylaxis.Therefore,thisresearchwasfocusedonthecloning,expressionandcharacterizationofcathepsinBgenefromT.solium.Wehaveachievedthefollowingresults:1.Making
8、useofthecDNAofT.soliumasatemplate,wefirstamplifiedcathepsinBgene.Wealsousedbioinformatictoolstoanalyzethegenesequence.ThesequenceanalysisshowedthatitsORFwas107
