耐輻射球菌中抗氧化蛋白dps(drb0092)的研究

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1、中文摘要耐輻射球菌(Deinococcusradiodurans)是地球上已知的輻射抗性最強的生物之一,它以對電離輻射、紫外線、干燥以及一系列DNA損傷試劑顯示超強的抗性而著稱。已有的研究顯示,抗氧化保護體系和高效的DNA損傷修復(fù)能力是該菌具有超強抗性的關(guān)鍵因素。然而,耐輻射球菌體內(nèi)存在的這種極端抗性機制至今仍不明確。因此,研究和鑒定耐輻射球菌體內(nèi)DNA保護及抗氧化相關(guān)的功能蛋白(或酶),闡明它們的生物學(xué)功能和生化特性,對進一步理解耐輻射球菌的極端抗性機制和探索其潛在的應(yīng)用價值具有非常重要的意義。Dps(斟A幽tectionduri

2、ngstarvation)蛋白是一類只存在于原核生物中具有抵抗多種逆境壓力功能的含鐵蛋白,與真核生物鐵蛋白(Ferritin)和細菌鐵蛋白(Bacterioferdtin)共同組成鐵蛋白超家族。Dps蛋白能通過兩種機制有效保護DNA免受損傷:1)Dps能結(jié)合游離態(tài)亞鐵離子,從而防止多余的Fe2+和H202發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基攻擊DNA;2)Dps蛋白與DNA直接結(jié)合形成結(jié)構(gòu)致密的蛋白一DNA生物共結(jié)晶體,從而在物理形態(tài)上保護DNA免受活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)等有害物質(zhì)的攻擊。耐輻

3、射球菌全基因組中有兩個基因編碼Dps蛋白,分別是位子I號染色體上的DR2263和位于大質(zhì)粒上的DRB0092基因。關(guān)于前者的生化特性和晶體結(jié)構(gòu)特征已有詳細的文獻報道。本研究圍繞后者,應(yīng)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)的方法進行鑒定,并對其基因功能和蛋白生化特性進行分析。研究結(jié)果如下:1.運用生物信息學(xué)方法對DRB0092基因和蛋白序列進行分析。發(fā)現(xiàn)DRB0092蛋白存在類似Ferritin(鐵蛋白)的保守結(jié)構(gòu)域,進一步證明了該蛋白屬于鐵蛋白超家族。通過ClustaIW程序?qū)RB0092蛋白和其它細菌Dps蛋白進行多序列比對,結(jié)果顯示DRB

4、0092蛋白與其它物種Ops蛋白的同源性并不高,但其N.端前端存在富含賴氨酸(Lys)保守位點的區(qū)域,可能為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域;蛋白中部存在Hisl00、Aspl27和Glul31等保守氨基酸殘基,推測為鐵氧化酶(ferroxidasc)保守結(jié)構(gòu)域。此外,分析結(jié)果顯示DRB0092蛋白在其N一端還具有其它Ops蛋白沒有的信號肽,預(yù)示著DRB0092蛋白可能具有其它Dps蛋白不具有的生化特性。2.用體外三段連接和體內(nèi)同源重組的方法對DRB0092進行全基因缺失突變。分析突變株和野生型菌株在電離輻照和過氧化氫處理下的生存率曲線,結(jié)果顯示突

5、變株的生存率較野生型均有明顯下降,而突變株補償Ops蛋白則能完全恢復(fù)野生型的表型。此外,Native-PAGE活性染色結(jié)果表明,DRB0092的缺失導(dǎo)致耐輻射球菌體內(nèi)過氧化氫酶(cAT)活性上調(diào),H202壓力條件下差異尤為顯著。3.通過在大腸桿菌中過表達DRB0092重組蛋白,我們得到純化的Dps-2重組蛋白,并對其進行體外生化功能鑒定.結(jié)果顯示:在交聯(lián)劑戊二醛作用下,含50mMNaCI的緩沖液中的單體Dps-2蛋白能形成三聚體、四聚體和十二聚體等各種多聚體形式;單體Dps.2蛋白不能結(jié)合pUCl9質(zhì)粒,但多聚體Dps-2蛋白能與質(zhì)

6、粒DNA發(fā)生非特異性結(jié)合,并能保護質(zhì)粒DNA免受Fe2+和H202發(fā)生Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基損傷。綜上所述,耐輻射球菌的Dps-2蛋白(DRB0092)具有明顯的DNA保護和抗氧化功能,在該菌的抗氧化體系中扮演舉足輕重的角色,可能是該菌極端抗性機制的重要組成部分。關(guān)鍵詞:耐輻射球菌;Ops蛋白;生物信息學(xué);基因突變;抗氧化;DNA保護2ABSTRACTDeinococcusradioduransisoneofthemostextraordinaryradiation-resistantorganismsontheearth.

7、Italsohasahi曲resistancetodesiccation,UV-ray,oxidativestreSSandavarietyofDNAdamagingagents.AlthoughalotofstudiesshowedthatthesemultipleresistantphenotypcsWaSattributedtoitsanti-oxidantsystemandhighlyefficientDNArepairprocess,themechanismoftheextremeresistanceinthisbacte

8、riumisstillunclear.Therefore,itisofsignificancetoidentifyandstudyonthefunctionalproteinswhichareinvolvedinDNArepairan

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