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1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文耐輻射球菌中RecA的調(diào)控蛋白研究姓名:盛多紅申請學(xué)位級別:博士專業(yè):生物物理學(xué)指導(dǎo)教師:華躍進(jìn)20050201浙江入學(xué)博士學(xué)位論文耐輻射球菌中RecA的調(diào)控蛋白砌}究耐輻射球菌中RecA的調(diào)控蛋白研究摘要本研究是對耐輻射球菌抗輻射機(jī)制研究的一部分,耐輻射球菌是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最抗輻射的生物之_,它可以耐受劑量超過15kGy的電離輻射而不發(fā)生突變,以往的研究發(fā)現(xiàn)耐輻射球菌的抗輻射表型和細(xì)胞內(nèi)有效的損傷DNA修復(fù)有關(guān),RecA在修復(fù)過程中扮演著重要角色,破壞recA基因后,耐輻射球菌失去了絕大部分輻射抗性?;蚪M
2、測序發(fā)現(xiàn),耐輻射球菌基因組缺乏recB、recC、recE、recd.recO和recT等參與重組修復(fù)的關(guān)鍵基因,RecA蛋白究竟以什么方式參與細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)還是一個(gè)謎。盡管發(fā)現(xiàn)pprl基因參與了耐輻射球菌RecA的表達(dá),但對RecA的調(diào)節(jié)機(jī)制仍然還不了解。本文參照一般細(xì)菌RecA的調(diào)節(jié)模式,發(fā)現(xiàn)耐輻射球菌編碼三個(gè)RccA調(diào)節(jié)蛋白類似物,包括兩個(gè)LexA和一個(gè)RecX,通過對它們的功能分析,研究RecA的調(diào)控機(jī)制,對揭開耐輻射球菌的高抗輻射機(jī)制有重要啟發(fā)意義。LexA是recA轉(zhuǎn)錄中的一個(gè)重要的抑制子。在大多數(shù)革蘭氏陰性菌
3、和革蘭氏陽性菌中,RecA的表達(dá)受DNA損傷的誘導(dǎo),并激活其輔蛋白酶活性催化LexA自裂解,釋放包括recA在內(nèi)的多種DNA損傷誘導(dǎo)基因的表達(dá)。耐輻射球菌內(nèi)有兩個(gè)LexA蛋白同源物,它們都具有LexA蛋白結(jié)構(gòu)域,包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,保守的裂解位點(diǎn)(Ala-Gly)和C末端的自裂解蛋白酶,可被RecA催化進(jìn)行自裂解反應(yīng)。Narumi等的研究認(rèn)為其中的一個(gè)LexA同源物(dra0344)不參與recA基因的誘導(dǎo)表達(dá),這使得了解另一個(gè)LexA同源物(dra0074)的活性對研究ReeA調(diào)控更有意義。本文構(gòu)建了基因dra0074的突變
4、菌株,通過免疫雜交和啟動(dòng)子活性分析,對比了野生型和突變體中ReeA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,LexA(dra0074)同樣不參與recA基因的誘導(dǎo)表達(dá),論證了耐輻射球菌RecA的表達(dá)不需要LexA蛋白。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LexA(dra0074)的功能可能與細(xì)胞內(nèi)的某種代謝有關(guān)。RecX是一個(gè)調(diào)節(jié)蛋白;發(fā)現(xiàn)于許多細(xì)菌中,它的編碼基因位于recA的下游,并且兩個(gè)基因通常共轉(zhuǎn)錄。一般認(rèn)為RecX能夠直接下調(diào)RecA蛋白活性,降低RecA過表達(dá)對細(xì)胞的損傷。和大多數(shù)細(xì)菌不同,耐輻射球菌的recX同源基因(drl310)位摘要于染色
5、體l上,距離recA基因較遠(yuǎn),它的具體功能還未作研究。本文構(gòu)建了基因drl310的突變菌株和過表達(dá)菌株,細(xì)胞水平分析表明耐輻射球菌RecX對RecA的活性具有抑制作用;進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),RecX不僅可以在蛋白質(zhì)水平抑制RecA蛋白的重組活性、ATP酶活性和輔蛋白酶活性,還可以在基因表達(dá)水平直接抑制RecA的表達(dá),表現(xiàn)出了雙重抑制活性,揭示RecX參與了RecA表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制。輻射產(chǎn)生的活性氧是造成細(xì)胞損傷的重要原因,因此抗氧化機(jī)制是細(xì)胞抗輻射的一個(gè)重要組成部分,RecX的缺失提高了細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性;通過對耐輻射球菌中重要的抗
6、氧化酶CAT和SOD活性的分析,發(fā)現(xiàn)RecX蛋白不影響CAT和SOD蛋白的活性,而是直接抑制它們的表達(dá)。盡管還不清楚RecX對抗氧化活性的影響和其調(diào)控RccA功能的關(guān)系,RccA,CAT和SOD都參與了耐輻射球菌的輻射損傷誘導(dǎo)反應(yīng),對它們表達(dá)的抑制表明RecX參與了這一誘導(dǎo)反應(yīng),RecX表現(xiàn)出了多方面的抑制活性。為了進(jìn)一步了解RecX蛋白在耐輻射球菌中的功能,進(jìn)行了雙向電泳分析實(shí)驗(yàn)。通過比較野生型和突變體的電泳圖譜以及隨后的蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定,在鑒定出的36種蛋白中,發(fā)現(xiàn)RecX可以抑制包括RecA、SSB、PprA、SOD等DN
7、A損傷誘導(dǎo)蛋白在內(nèi)的12種蛋白的表達(dá),同時(shí)可以提高其他23種蛋白的表達(dá)量,他們分別屬于基因轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝,能量轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝等途徑。上述結(jié)果表明,RecX參與了輻射誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng),RecX缺失的情況下,可以釋放包括recA在內(nèi)的多種DNA損傷誘導(dǎo)基因的表達(dá)、抑制多種細(xì)胞內(nèi)正常的代謝,包括氨基酸,糖類和脂類代謝,以及能量代謝,似乎與DNA損傷檢測點(diǎn)反應(yīng)有關(guān)。綜上所述,耐輻射球菌的LexA(dra0074)是~個(gè)調(diào)節(jié)蛋白,但是不參與RecA的誘導(dǎo)表達(dá):RecX作為耐輻射球菌輻射抗性的一個(gè)多功能抑制子,參與了RecA
8、活性的調(diào)節(jié),在基因組穩(wěn)定性和輻射誘導(dǎo)的重組修復(fù)中起著雙重負(fù)調(diào)節(jié)作用。關(guān)鍵詞:D.radiodurans,RecA,RecX,LexAV浙}【.人學(xué)
9、尊士學(xué)位論文耐輻射球菌中RecA的調(diào)控蛋F{研究RegulatoryproteinsofRecAinDeinoco