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《基于rna--seq的陽春砂果實發(fā)育過程中糖和萜類代謝的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、廣州中醫(yī)藥大學學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是個人在導師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經特別加以注明引用的內容外，本論文不含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明并致謝。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者簽名主垂豇El期：加l牛年歲月弓。日關于學位論文使用授權的聲明本人完全了解廣州中醫(yī)藥大學有關保留使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留或向國家有關部門機構送交論文的復印件和電子版，允許被查閱和借閱。本人授權廣州中醫(yī)藥大學可以
2、將本學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復印手段保存和匯編本學位論文。(保密論文在解密后應遵守此規(guī)定)論文作者簽名童遣＆論文導師簽名日期：20l牛年了月30B基于RNA．Seq的陽春砂果實發(fā)育過程中糖和萜類代謝的研究作者：于安民導師：楊錦芬研究員摘要陽春砂(AmomumvillosumLour．)是中藥砂仁的主要來源植物，以干燥成熟果實入藥，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎之功能。砂仁作為我國傳統(tǒng)常用藥材，市場需求量很大，但由于栽培面積小、產量低，嚴重地制約了藥源的擴大和產量的提高。1目的利用新一代高通量測序
3、技術，對陽春砂進行轉錄組測序，以獲得該物種的參考序列。通過對幼果、成熟中期果實和成熟末期果實進行RNA．Seq表達譜測序，分析3個不同發(fā)育時期果實中基因表達量的變化，建立基因表達量與糖含量、糖代謝酶活性以及揮發(fā)性萜類含量之間的聯(lián)系。砂探索限制陽春砂果實產量和有效成分含量的因素。2方法2．1陽春砂轉錄組測序及數(shù)據挖掘分別提取陽春砂全植株(花除外)的RNA，等量混合后構建cDNA文庫，用IlluminaHiSeq2000平臺進行高通量轉錄組測序。利用SOAPdenovo分析軟件對獲得的高質量序列進行從頭組裝，得到unigene序列。通過與公共數(shù)據庫
4、Nr、Swiss．Prot、KEGG和COG比對，進行unigene功能注釋。分析獲得注釋的unigenes預測蛋白質編碼序列(CDS，CodingSequence)和簡單重復序列(SSR，simplesequencerepeat)。對陽春砂轉錄組中糖和萜類代謝的KEGG通路進行深入分析。通過MEGA軟件構建分子進化樹，對萜類合成途徑中的3個關鍵酶基因HMGR(3．hydroxy一3．methylglutaryl-CoAreductase，3-羥基一3-甲基戊二酰輔酶A還原酶)、DXR(1-deoxy-D—xylulose-5-phosphat
5、ereductoisomerase，1-去氧-D-木酮糖．5一磷酸還原異構酶)和DXS(1-deoxy-D-xylulose一5一phosphatesynthase，1-去氧．D．木酮糖．5．磷酸合成酶)基因的多個unigenes進行分類。通過PSI．BLAST對部分未在KEGG代謝通路中注釋到的單萜、倍半萜合酶基因進行蛋白質同源比對。2．2陽春砂不同發(fā)育期果實的表達譜分析及糖和萜類代謝相關差異表達基因的篩選對3個不同發(fā)育時期(幼果期、成熟中期、成熟末期)的果實進行RNA．Seq表達譜測序，篩選出差異表達基因后，進行表達趨勢分析。重點分析與糖代
6、謝、萜類代謝以及轉錄因子相關的差異表達基因，并選擇部分差異表達基因進行qPCR驗證。提取陽春砂果實不同發(fā)育期、不同部位(果皮和種子團)總RNA，反轉錄為cDNA。選擇糖和萜類代謝中的部分差異表達基因的unigenes作為目的基因，設計并合成引物，qPCR檢測基因相對表達量，并結合表達譜數(shù)據進行分析。2．3不同發(fā)育時期陽春砂果實糖及萜類代謝研究將3個不同發(fā)育時期的果實分為果皮和種子團，分別用乙醇、酶提取緩沖液提取可溶性糖和粗酶，HPLC法測定可溶性糖含量，紫外分光光度法測定酶活性。石油醚微波萃取法提取揮發(fā)性萜類，通過GC／MS測定揮發(fā)性萜類的含量
7、。3結果3．1陽春砂轉錄組數(shù)據挖掘通過高通量RNA．Seq測序獲得了陽春砂全轉錄本信息，共得到144，020個unigenes序列。對unigenes進行基因功能注釋，通過COG功能分類，26，303個unigenes歸到25個功能類別。通過GO數(shù)據庫注釋，31，978個unigenes被歸類到44個功能類別中，其中歸類到代謝過程的unigenes有14，456個。通過KEGG代謝通路分析，將21，254個unigenes分為270類，淀粉和蔗糖代謝通路相關的unigenes有567個，萜類骨架生物合成途徑的unigenes有154個。搜索到了
8、12，715個SSR位點，其中重復次數(shù)最多是三核苷酸重復。通過構建分子進化樹，對陽春砂的HMGR、DXR和DXS的多個unigenes進行了分類和功能
