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1、蝗綠僵菌CQMa102體表入侵相關(guān)基因MaChy的克隆和分析重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)生姓名：姚秀清指導(dǎo)教師：夏玉先教授專業(yè)：生物學(xué)學(xué)科門類：理學(xué)重慶大學(xué)生物工程學(xué)院二O一一年十一月CloningandFunctionalAnalysisofMaChygeneinMetarhiziumacridumAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofScienceByXiuqingYaoSupervisedbyProf.YuxianXiaMa
2、jor:BiologyCollegeofBioengineeringofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaNov.2011重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要摘要蝗綠僵菌（Metarhiziumacridum）是一類應(yīng)用廣泛的蟲生真菌，在農(nóng)業(yè)害蟲生物防治中起著重要作用。蟲生真菌的致病力是影響其廣泛使用的主要限制因素，迄今為止，實(shí)驗(yàn)室在前期工作中構(gòu)建了蝗綠僵菌CQMa102在侵染過程中，相比于體內(nèi)，在體表時(shí)期的高表達(dá)的差減文庫，從此文庫中，選擇了蝗綠僵菌CQMa102體表時(shí)期高表達(dá)的一條EST序列，該EST序列長750bp，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)該序列與其他
3、物種中的氰化物水合酶的同源性較高。利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的蝗綠僵菌CQMa102在產(chǎn)孢時(shí)期的均一化全長cDNA文庫，獲取了該基因（MaChy）的cDNA全長。通過以基因組為模板PCR擴(kuò)增后克隆測序的方式，成功獲取了MaChy基因的DNA全長。利用RNAi的方法研究了MaChy的功能。主要研究結(jié)果如下：①獲得了MaChy基因的cDNA全長，并進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析。MaChy基因cDNA序列全長為1202bp，5’端有80bp的UTR區(qū)域，3’端有50bpUTR區(qū)域，其開放閱讀框?yàn)?074bp。預(yù)測該基因編碼357個(gè)氨基酸，與多個(gè)物種如eptosphaeriamaculans(A
4、AF66098.1)、Aspergillusniger(XP_001389844.1)、Fusariumsolani(CAM82815.1)、Neurosporacrassa(XP_960160.2)、PenicilliumchrysogenumWisconsin(XP_002562104.1)、Aspergillusniger(ABX75546.1)、Alternariabrassicicola(AAP88966.1)對應(yīng)所編碼都有97%以上的蛋白同源性。該蛋白沒有信號肽，也不具有跨膜的結(jié)構(gòu)。②生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，該蛋白的分子量39.78kDa,等電點(diǎn)為5.53。為酸
5、性蛋白。預(yù)測其在177位（NASK）、206位（NASE）、332位（NSTD）氨基酸處存在N-糖基化位點(diǎn)；4位（TIR）、77位（SMR）、300位（TKK）、323位（TPK）氨基酸處存在蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)；104位(SELD)、134位（THVE）、179位（SKHE）、341（STLE）處有一個(gè)酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn)；122位（GTVINH）、144位（GSGDSL）、238位（GARLGL）、262位（GNGYSR）N-十四?；稽c(diǎn)。③通過PCR擴(kuò)增基因組送測序后，獲取了MaChy基因的DNA全長，將DNA序列與cDNA序列用DNAMAN軟件比對，結(jié)果顯示：Ma
6、Chy基因不含內(nèi)含子，DNA全長1202bp。④采用RNAi的方法進(jìn)行MaChy基因的功能研究。構(gòu)建MaChy基因的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的RNA干擾載體后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化蝗綠僵菌CQMa102中，經(jīng)過培養(yǎng)基的初篩和PCR篩選后，獲得多個(gè)穩(wěn)定的MaChy基因干擾突變株。⑤分析了MaChy基因干擾突變株的毒力變化，統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)干擾突變株和出發(fā)菌株的半數(shù)致死時(shí)間沒有顯著差異，推測MaChy基因的功能與毒力不相關(guān)。I重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要⑥觀察干擾突變株與出發(fā)菌株在附著胞形成方面的差異，從多個(gè)角度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，在附著胞形成比率，形成時(shí)間，附著胞形態(tài)，附著胞大小都沒有顯著
7、的差異。⑦分析了MaChy基因在體表和體內(nèi)的表達(dá)差異。統(tǒng)計(jì)定量PCR數(shù)據(jù)得到的結(jié)論顯示，在體表階段的表達(dá)量最高，大約是體內(nèi)表達(dá)量的2.5倍，而在1/4SDA液體培養(yǎng)基中的表達(dá)量與體內(nèi)表達(dá)量基本相同，表明該基因在體表階段是高表達(dá)的。關(guān)鍵詞：綠僵菌，MaChy基因，RNAi，干擾突變株II重慶大學(xué)碩士學(xué)位論文英文摘要ABSTRACTTheascomycetesMetarhiziumacridumwaswellcharacterizedentomopathogenicfungiandwidelyusedinbiologi
