金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析

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1、金龜子綠僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析【摘要】　　目的獲得酸性海藻糖酶基因(ATM1)并對(duì)其序列進(jìn)行分析。方法根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增出金龜子綠僵菌ATM1的cDNA和DNA序列,對(duì)其推導(dǎo)的氨基酸序列基于多序列局部比對(duì)和結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)進(jìn)行分析。結(jié)果ATM1cDNA序列包含開放閱讀框(ORF)3219bp,3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)175bp和5’端非翻譯區(qū)(5’UTR)498bp。結(jié)論成功獲得ATM1基因，通過序列分析確定出4組保守性功能序列。ATM1基因在CQMal02基因組中為單拷貝?！娟P(guān)鍵詞】真菌；海藻糖酶；序列比對(duì)　　海藻糖是一種非還原性二

2、糖，占昆蟲血淋巴中糖類80%～90%，在昆蟲血液生理中起著重要作用，其耗竭可能對(duì)昆蟲產(chǎn)生致命性的作用[1]。金龜子綠僵菌（metarhiziumanisopliae，M.a）是一類應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌，在昆蟲防治中起著重要作用。M.a侵染進(jìn)入昆蟲血淋巴后，海藻糖成為其生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)，綠僵菌能分泌酸性海藻糖酶，有效降解昆蟲血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌對(duì)昆蟲的致病過程中起著重要作用[2]。目前對(duì)真菌酸性海藻糖酶的研究只有少數(shù)幾個(gè)物種的酸性海藻糖酶基因被克隆并測定序列[35]。本試驗(yàn)分離克隆M.aCQMal02的酸性海藻糖酶ATM1基因，并進(jìn)行全序

3、列分析，為構(gòu)建M.aCQMal02ATM1基因高效表達(dá)載體和干擾載體、對(duì)酸性海藻糖酶功能的進(jìn)一步研究和采用基因工程手段改造綠僵菌菌株、提高其殺蟲毒力提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)儲(chǔ)備?！　?材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌株和質(zhì)粒M.a菌株CQMa102由重慶大學(xué)基因工程中心自罹病竹蝗僵蟲體內(nèi)分離培養(yǎng)純化獲得，中國微生物所菌種保存中心保存（保存編號(hào)0877）；質(zhì)粒pMD18T（日本Takara公司）?！　?.1.2主要試劑PrimeSTARTMDNAPolymerase、3’FullRACECoreSet，SmartTMPCRcDNASynthesisKit（日

4、本Takara公司）；限制性內(nèi)切酶、牛小腸堿性磷酸酶(CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、mRNA提取試劑盒和PrimeaGeneLabelingSystem標(biāo)記試劑盒（美國Promega公司）；HybondN尼龍膜（瑞典Phamarcia公司）；同位素aP32dCTP（北京福瑞生物工程公司）。　　1.2方法　　1.2.1引物設(shè)計(jì)為獲得ATM1基因cDNA的3’端和5’端序列，采用了3'RACE和SMART5'RACE法(rapidamplificationofcDNAends)法，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已獲得的M.a酸性海藻糖酶部分肽段測序結(jié)果，設(shè)計(jì)引

5、物如下：　　AT631F　　上游：5’AATGTGGACAGCATCTCGGTTTGGAV3’　　AT948F　　上游：5’TATCGTTTGTCAACCAACTCGTCGCG3’　　　　反轉(zhuǎn)錄引物　　S3：5’CAGTTCTGGTGATCC3’　　S4（下游）：5’TGGCGCTGCAAAGACCGAGAG3’　　S5（下游）：5’TTGATGGGCTCGCGAGTT3’　　為獲得ATM1基因DNA序列，根據(jù)ATM1基因全長cDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物E1、E2，PCR擴(kuò)增出ATM1DNA序列?！　1(上游)：5’GTTGTCCCGGTG

6、GCATTTGCTT3’　　E2(下游)：5’CATGTGATGGCCACTCCT3’　　1.2.2總DNA和mRNA的提取將M.a孢子106接種于20mL1／4SDA(1／4StrengthSabouraudsDextroseAgar)培養(yǎng)液，180r／min離心，26～28℃培養(yǎng)60h，10000r／min離心5min，沉淀菌絲，無菌水沖洗2次，提取M.aCQMal02總DNA?！　.aCQMa102孢子106接種于酸性海藻糖酶產(chǎn)酶誘導(dǎo)培養(yǎng)液中[可溶性淀粉10g/L,海藻糖10g/L,硫酸銨2g/L,氯化鉀1g/L,五水硫酸鎂0.5g/L,磷酸二

7、氫鉀1g/L,2（N嗎啉）乙基磺酸10g/L,微量元素（0.1%七水硫酸亞鐵，0.3%五水硫酸鋅）10mL/L,pH調(diào)至6.0～6.1]培養(yǎng)60h后，收集M.aCQMa102新鮮菌絲，無菌水沖洗2次，加入液氮研磨成粉末，稱取約50mg菌絲粉末，用試劑盒提取mRNA。提取過程參照試劑盒說明書進(jìn)行?！　?.2.3克隆ATM1基因5’端和3’端cDNA序列根據(jù)M.aCQMal02酸性海藻糖酶已知的肽段測序結(jié)果，設(shè)計(jì)一條反轉(zhuǎn)錄引物S3和2條嵌套式PCR引物S4及S5，以M.aCQMal02mRNA500ng為模板，按照5’FullRACECoreSet描述的操作

8、程序進(jìn)行,首先以S3為反