細(xì)胞毒殺試驗(yàn)sop20120904-簡(jiǎn)體版

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1、一、目的(Purpose)：建立癌細(xì)胞毒殺活性分析的方法與流程二、方法(Method)：將血液以Ficoll進(jìn)行離心分離后，將人類外圍口血球(PBMC)與K562細(xì)胞共同培養(yǎng)，透過被破壞細(xì)胞所釋放出的LDH(lactatedehydrogenase),評(píng)估PBMC對(duì)于K562細(xì)胞的毒殺能力評(píng)估。三、材料(Material)1?實(shí)驗(yàn)所需儀器1.1.無菌操作臺(tái)(Laminarflow)12分光亮度計(jì)(InfiniteM200,TECAN)1.3.37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱1415ml離心管1.5.96孔U型細(xì)胞培養(yǎng)盤1.6.Ficoll-Paquepremium1.7.96孔Immunoplate1.

2、8.懸臂式離心機(jī)1.9.75T細(xì)胞培養(yǎng)皿及25T細(xì)胞培養(yǎng)皿1.10.3ml無菌拋棄式塑料滴管1.11.20?200⑴微量分注器及10?1000)11微量分注器1.12.已滅菌200pltip及已滅菌1000

3、11tip1.13.95%酒精及酒精燈1.14.1.5mleppendorf及棕色eppendrof1.15.50孔15ml離心管架1.16.細(xì)胞計(jì)數(shù)器1.17.0.22gm過濾杯1.1&水浴槽2?實(shí)驗(yàn)所需試劑2.1.CytoTox96?Non-RadioactiveCytotoxicityAssay(PromegaCat.No.G1780)2.2.RPMI-1640medium(Gi

4、bcoCat.No22400-071)2.3.FBS(胎牛血清)(GibcoCat.No.10091-148)2.4.PSN(Penicillin-Streptomycin-Neomycin(PSN)AntibioticMixture,GibcoCat.No.15640-055)2.5.10XPBSbuffer或IXPBSbuffer2.6.TrypanBlueSolution(FlukaCat.No.93595,0.4%formicroscopy)2?試劑配制3丄配制lxPBSbuffer3.1.1?在1000ml量筒量取100mlI0XPBSbuffer,再加入RO水至量筒刻度1000

5、ml的位置。3.12混合均勻后，倒入1L的血清瓶中，旋上蓋子后微旋松，貼上滅菌帶，進(jìn)行121°C、20分鐘高壓滅菌。3.1.3.滅菌完成后取出，將蓋子旋緊，置于室溫備用。3.1.4.進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作吋取用需于無菌操作臺(tái)內(nèi)操作。32配制1L的70%酒精3.2.1.一般實(shí)驗(yàn)室可購買為95%酒精：95%xVl=70%xl0/.V1=7.37L（公升）322.依據(jù)上述估算結(jié)果，量取95%酒精7.37L（即7370ml的酒精）；323.加入2.63L（10—7.37二2.63）的R.O.水，混合均勻即可。3.3.LDHSubstrateMix試劑配制方法（不需丁-無菌操作臺(tái)內(nèi)操作）3.3.1.將?20°

6、C的CytoTox96?Non-RadioactiveCytotoxicityAssaykit中的LDHassaybuffer置于室溫屮回溫溶解。3.32將LDHassaybuffer平均分裝于5管15ml離心管，每管12ml。3.3.3.用鋁箔紙包裹15ml離心管避光，置于?20°C保存?zhèn)溆谩?.3.4.配制時(shí)，從?20°C取岀分裝好的LDHassaybuffer（12ml）置于室溫中回溶。3.3.5.待LDHassaybuffer完全變成液體后，將buffer加入從?20°C拿擊來的substratemixpowder屮（蓋子可能沾有粉末，因此開蓋時(shí)請(qǐng)小心）。3.3.6.混合均勻后，分

7、裝到1.5mleppendorf中（建議以棕色eppendrof分裝），放冋?20°C保存使用，過程中請(qǐng)避光操作。3?4?配制含10%FBS之RPMI-1640medium（需要在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行，確保無菌狀態(tài)）3.4.1.^FBS^-20°C冰箱中取出，于室溫或是37°C水浴解凍后，以56°C、30分鐘水浴去補(bǔ)體,再分裝到50ml離心管中。為避免爆管污染的情形發(fā)生，每管約分裝45ml的FBS,以parafilm封好管口,再放到?20°C中冰凍保存?zhèn)溆谩?.42將100XL-glutamine^-20°C冰箱中取岀，在37°C水浴中解凍并至底部白色粉末完全溶解，再分裝到15ml離心管中。為

8、避免爆管污染的情形發(fā)生，每管約分裝12011的100乂L-glutamine,以parafilm封好管口,再放到?20°C中冰凍保存?zhèn)溆谩?.4.3.將100XPSN從?20°C冰箱屮取出，于4°C冰箱屮解凍后，直接分裝到15ml離心管中。為避免爆管污染的情形發(fā)生，每管約分裝12ml的100XPSN,以parafilm封好管口，再放到?20°C中冰凍保存?zhèn)溆谩?.4.3.配制1L含10%FBS之RPMI-1640medi