dna分子標記及其在冬蟲夏草研究中的應用

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1、食用菌學報2002.9(3):52~56ActaEdulisFungi文章編號:1005-9873(2002)03-52-05DNA分子標記及其在冬蟲夏草研究中的應用宋敦倫張軍陳建新(中國農業(yè)大學昆蟲系,北京100094)摘要:概述了DNA分子標記技術的發(fā)展過程、種類、基本原理和特點,并介紹了其在冬蟲夏草研究領域中的應用和前景。關鍵詞:DNA;分子標記;冬蟲夏草中圖分類號:S567.35;Q943.2文獻標識碼:A隨著分子生物學技術的迅速發(fā)展,在生物學領域誕生了直接從DNA水平上進行遺傳分析的分子標記

2、技術。進入90年代以來,DNA分子標記在冬蟲夏草研究中也得到了廣泛的應用。DNA分子標記(DNAmolecularmarker)是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記,它可以反映生物個體或種群基因組的差異,而這種差異可以通過將基因組DNA經(jīng)限制性內切酶酶切、PCR擴增、分子雜交等技術在凝膠電泳上檢測出來。與傳統(tǒng)的形態(tài)學標記和同工酶標記相比,DNA分子標記具有以下幾個優(yōu)點:①直接以DNA為表現(xiàn)形式,不受生物的生長條件和發(fā)育階段的影響,在生物的任何生長階段都可以檢測;②由于基因組DNA的變異極

3、其豐富,分子標記的數(shù)量幾乎是無限的;③檢測手段簡單、迅速。自從1980年人們認識到生物個體間DNA序列的差異可被用作遺傳標記以來,DNA分子標記技術便得到了迅猛的發(fā)展,相繼有數(shù)十種DNA分子標記技術問世。1DNA分子標記的種類1.1限制性片段長度多態(tài)性(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,RFLP)[1]RFLP出現(xiàn)最早,也稱為第一代DNA分子標記,是由BosteinD首先提出的基于South2ern雜交技術的一種分子標記,其原理是檢測DNA在限制性內切酶酶切后

4、形成的特定大小的DNA片段。由于不同來源DNA的特定的限制性內切酶酶切位點分布不同,每一種DNA與限制性內切酶酶切所產生的片段大小都是特異的,從而產生了多態(tài)性。RFLP技術的基本步驟是:先將供試基因組DNA酶切,通過瓊脂糖凝膠電泳分離得到片段,在原位進行變性后轉移至硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上,再用經(jīng)放射性標記的DNA或RNA與固定于濾膜上的DNA雜交,最后通過放射性自顯影確定與探針互補的電泳譜帶位置,從而確定同源片段的大小。對于分子量較小的DNA樣本,也可以在酶切后對其產物直接進行電泳分析,得到DNA的

5、RFLP圖譜。RFLP標記非常穩(wěn)定,在所有生物中的檢測程序一致,標記數(shù)量較大。可以用RFLP來收稿日期:2002-04-26原稿;2002-05-28修改稿3期宋敦倫等:DNA分子標記及其在冬蟲夏草研究中的應用53構建遺傳圖譜,但是采用Southern雜交技術的RFLP操作較復雜,成本高,檢測中要用放射性同位素,限制了它在實際操作中的應用。1.2以PCR為基礎的分子標記隨著聚合酶鏈式反應(PolymeraseChainReaction,PCR)技術的發(fā)展,誕生了許多在PCR基礎上改進的第二代分子標記技

6、術。1.2.1隨機擴增多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNA,RAPD)RAPD是90年[2]代初由WilliamsJGK和WelsonJ分別獨立發(fā)展起來的一項新的分子標記技術,與RFLP一樣,RAPD也是以檢測DNA的多態(tài)性為目的,但RAPD是通過聚合酶鏈式反應特異擴增DNA片段的多態(tài)性。通常采用多個具有10bp左右的寡聚核苷酸作隨機引物,通過PCR反應產生不連續(xù)的DNA產物,由于不同基因組DNA序列存在差異,其與隨機引物的結合位點不同,擴增產物的數(shù)量、大小就不同,

7、因而可通過凝膠電泳觀察DNA多態(tài)性。RAPD簡便迅速,不需要放射性同位素、Southern印跡等繁瑣程序,且樣品需要量少,靈敏度高,缺點是RAPD對模板2+濃度、Mg濃度等反應條件相當敏感,所以試驗的重復性較差。1.2.2簡單重復序列(SimpleSequenceRepeat,SSR)的多態(tài)性SSR是利用真核生物基因組[4]中存在的大量重復序列(微衛(wèi)星序列)設計引物,擴增串聯(lián)的重復序列,依據(jù)微衛(wèi)星寡核苷[5]酸的重復次數(shù)在同一物種不同基因型間的差異,揭示長度多態(tài)性。使用聚丙烯酰胺凝膠電泳可提高其分辨率

8、,可檢測出單拷貝的差異,其檢測快速、信息量大,但成本高,工作量較大,目前SSR標記已在主要的農作物研究中得到應用。1.2.3擴增片段長度多態(tài)性(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP)AFLP是[6]1992年由荷蘭ZabeauM和VosP在PCR和RFLP的基礎上發(fā)展起來的新一代分子標記技術,它結合了RFLP和RAPD技術的優(yōu)點,具有分辨率高、效率高和穩(wěn)定性好的優(yōu)點。AFLP的原理是:先利用限制性內切酶水解基因

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