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1、分類號(hào)：S966.9密級(jí)：UDC：639.4學(xué)號(hào)：2111501020碩士學(xué)位論文九孔鮑MSTN、BMP-2基因克隆、表達(dá)及SNP位點(diǎn)篩選艾加林指導(dǎo)教師：栗志民教授申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向：水產(chǎn)無(wú)脊椎動(dòng)物增養(yǎng)殖及珍珠培育學(xué)院名稱：水產(chǎn)學(xué)院中國(guó)·湛江2018年6月`九孔鮑MSTN、BMP-2基因克隆、表達(dá)及SNP位點(diǎn)篩選摘要九孔鮑(Haliotisdiversicolorsupertexta)是中國(guó)南方沿海具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的海水養(yǎng)殖貝類，20世紀(jì)90年代中后期以來，開始爆發(fā)疾病導(dǎo)致九孔鮑大規(guī)模死亡，給九孔鮑產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重的
2、經(jīng)濟(jì)損失，限制了我國(guó)九孔鮑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種質(zhì)退化是九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要原因，通過遺傳改良選育出抗性強(qiáng)，培育出生長(zhǎng)快的品種是解決九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要途徑。在分子水平研究生長(zhǎng)相關(guān)基因的分子調(diào)控機(jī)制并篩選與生長(zhǎng)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，有助于培育出抗性強(qiáng)、生長(zhǎng)快的九孔鮑品種。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族(transforminggrowthfactortypebeta，TGF-β)是一組具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的多功能分泌型細(xì)胞因子，參與細(xì)胞增殖、分化和生長(zhǎng)等多種生物學(xué)過程。肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族(TGF-β)中參與動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)的重要調(diào)控
3、因子，是經(jīng)濟(jì)動(dòng)物遺傳改良的重要候選基因；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族(TGF-β)中最大的分泌型信號(hào)傳導(dǎo)分子，在動(dòng)物的骨骼發(fā)育及器官形成中具有重要作用，BMP-2基因是BMP家族的重要成員，在信號(hào)傳遞、貝殼形成過程中具有重要作用。為探究MSTN、BMP-2基因在九孔鮑中的功能，克隆九孔鮑MSTN、BMP-2基因cDNA全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)分析了基因序列和氨基酸特征，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢了MSTN、BMP-2基因在各組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)水平。為探究九孔鮑MSTN、BMP-2基因的多態(tài)性及生長(zhǎng)相關(guān)性，采
4、用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法對(duì)九孔鮑MSTN、BMP-2基因進(jìn)行SNP篩選，并通過基因多態(tài)性與九孔鮑體質(zhì)量、殼長(zhǎng)、殼寬進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了MSTN基因不同基因型九孔鮑的表達(dá)水平。為九孔鮑生長(zhǎng)相關(guān)分子機(jī)制的研究、生長(zhǎng)標(biāo)記的開發(fā)和標(biāo)記輔助選擇育種提供參考。主要研究結(jié)果如下：1、九孔鮑MSTN基因cDNA克隆及表達(dá)采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從九孔鮑右側(cè)殼肌中獲得了MSTN基因cDNA全長(zhǎng)3755bp，其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)324bp，3′非編碼區(qū)(3′UTR)1985bp，開放閱讀框(ORF)1446bp，
5、編碼481個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為54.96ku，理論等電點(diǎn)pI：9.41；具有N端信號(hào)肽(1-17aa)、TGF-β前肽區(qū)域(157-367aa)和成熟肽區(qū)域(379-481aa)，以及蛋白酶水解位點(diǎn)RRPR(364-368aa)和C末端生物活性區(qū)9個(gè)保守的半胱氨酸殘基，符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征，且預(yù)測(cè)到2個(gè)新的蛋白酶水解位點(diǎn)RQRR(120-124aa)、RYRR(235-239aa)。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示九孔鮑MSTN基因和紅鮑MSTN基因聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明，九孔鮑MSTN基因在檢測(cè)的6個(gè)組織均表達(dá)且在足、右側(cè)殼肌、
6、外套膜中高表達(dá)，在鰓、性腺、肝臟中低表I達(dá)；在檢測(cè)的7個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá)且在受精卵、原腸胚、稚鮑時(shí)期高表達(dá)，在卵、4細(xì)胞、8細(xì)胞時(shí)期、幼鮑時(shí)期表達(dá)量較低。研究表明MSTN基因可能在九孔鮑肌肉生長(zhǎng)中具有重要作用。2、九孔鮑BMP-2基因cDNA克隆及表達(dá)采用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從九孔鮑外套膜中獲得了BMP-2基因cDNA全長(zhǎng)2572bp，其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)123bp，3′非編碼區(qū)(3′UTR)1150bp，開放閱讀框(ORF)為1299bp，編碼432個(gè)氨基酸，其分子質(zhì)量為48.59ku，理論等電點(diǎn)(pI)為9.84；
7、具有N端信號(hào)肽(1-39aa)、TGF-β前肽區(qū)域(63-294aa)和TGF-β成熟肽區(qū)域(331-432aa)，以及蛋白酶水解位點(diǎn)RLRR(272-275aa)和7個(gè)保守的半胱氨酸殘基，符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示九孔鮑BMP-2基因和耳鮑聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明，BMP-2基因在九孔鮑的6個(gè)組織中均有表達(dá)，在足、右側(cè)殼肌、外套膜及肝臟中顯著高表達(dá)；在檢測(cè)的7個(gè)發(fā)育時(shí)期均表達(dá)，其中在受精卵、4細(xì)胞、8細(xì)胞、原腸胚、稚鮑時(shí)期表達(dá)量顯著高于卵、幼鮑時(shí)期。研究表明BMP-2基因可能在九孔鮑貝殼形成中具有重要作
8、用。3、九孔鮑MSTN基因多態(tài)性及與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析實(shí)驗(yàn)采用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序的方法在九孔鮑MSTN基因中，共篩選出了9個(gè)SNP位點(diǎn)，5′非編碼區(qū)(5′UTR)1個(gè)
