tiaml相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究

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1、南方醫(yī)科大學(xué)2010級(jí)博士學(xué)位論文Tiaml相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究ScreeningandIdentificationofproteininteractingwithTiamlanditspreliminaryfunctionalstudies課題來(lái)源：國(guó)家自然科學(xué)基金(30801380，81101822)廣州市科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(11C26090521)學(xué)位申請(qǐng)人導(dǎo)師姓名專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)培養(yǎng)類(lèi)型培養(yǎng)層次所在學(xué)院黃靜陳龍華教授腫瘤學(xué)專(zhuān)業(yè)學(xué)位全日制博士第一臨床醫(yī)學(xué)院2013年3月20日廣州博士學(xué)位論文Tiaml相互作用蛋白

2、的篩選、鑒定及其功能的初步研究ScreeningandIdentificationofproteininteractingwithTiamlanditspreliminaryfunctionalstudies博士研究生：黃靜指導(dǎo)教師：陳龍華摘要研究背景和目的原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HepatoceUularcaicinoma，HCC；簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是世界上最常見(jiàn)惡性腫瘤之一。其死亡率位居全球惡性腫瘤死亡的第3位，在我國(guó)已上升至第2位，總體發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。盡管近半個(gè)世紀(jì)來(lái)早期診斷、手術(shù)切除及藥物治療等方面不斷發(fā)展，但肝癌患者的5年生存

3、率仍然很低。臨床上有54．1％～61．5％的HCC在行根治性切除后5年復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移仍然是影響肝癌預(yù)后的主要原因。因此，探討與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)因素，尋找預(yù)防和治療的有效途徑，提高病人的生存率，降低死亡率是目前肝癌研究的重點(diǎn)。腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，侵入血管或淋巴管，遷移、粘附于適宜部位，誘導(dǎo)腫瘤血管形成，對(duì)抗宿主抗腫瘤免疫，最終在遠(yuǎn)處形成轉(zhuǎn)移灶。在這一過(guò)程中，涉及到多基因的參與。目前研究腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制大多關(guān)注癌基因、抑癌基因、小分子RNA等單個(gè)或多個(gè)分子的作用和功能，而蛋白質(zhì)作為基

4、因編碼產(chǎn)物，是生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者，其在腫瘤中的表達(dá)、對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展所起的作用，仍有待闡明。近年中文摘要來(lái)開(kāi)展的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為揭示腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制帶來(lái)了新的希望，而對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能研究也成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Tiaml(TlymphomainvasionandInetaStasisl，T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移基因)蛋白是我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)的肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白。在前期研究中，我們通過(guò)對(duì)213例具有完整臨床隨訪(fǎng)資料的肝癌組織標(biāo)本進(jìn)行了免疫組織化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示：Tiaml在肝癌組織中高表達(dá)，且表達(dá)水平與肝癌患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為

5、判斷肝癌患者預(yù)后的指標(biāo)。Tiaml在8種肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于人正常肝細(xì)胞株。我們以人原發(fā)性肝癌高、低轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(HCCLM6，MHCC97L)為研究對(duì)象，采用基因轉(zhuǎn)染和RNAi技術(shù)從細(xì)胞和動(dòng)物水平證明了Tiaml過(guò)表達(dá)能促進(jìn)肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，相反沉默內(nèi)源性Tiaml表達(dá)降低了肝癌增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。研究結(jié)果為闡明肝癌轉(zhuǎn)移機(jī)制及尋找預(yù)測(cè)肝癌轉(zhuǎn)移的潛在標(biāo)志物提供了理論依據(jù)。尋找Tiaml蛋白的相互作用蛋白是進(jìn)一步理解Tiaml蛋白功能的一個(gè)重要途徑。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選Tiaml相互作用蛋白

6、，為闡明肝癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)理，尋找腫瘤早期診斷和治療的靶標(biāo)提供重要理論依據(jù)。方法1．酵母雙雜交篩選Tiaml相互作用蛋白1．1構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體首先應(yīng)用基因重組技術(shù)，以商品化的人TiamlcDNA克隆為模板，構(gòu)建Tiaml蛋白酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7．Tiaml／C1199。將其轉(zhuǎn)化到酵母菌株AHl09中，檢測(cè)Tiaml蛋白在酵母菌株中的表達(dá)情況，分析有無(wú)毒性和自激活活性。1．2利用cDNA文庫(kù)篩選Tiaml相互作用蛋白利用經(jīng)典的PE肌m酵母轉(zhuǎn)化法，采用大規(guī)模轉(zhuǎn)化技術(shù)，以pGBKT7．Tiaml／C1199重組蛋白為誘餌，篩

7、選“UniversalHumanMate&Plate”文庫(kù)。選取初篩獲得的陽(yáng)性克隆，進(jìn)行質(zhì)粒抽提、分離文庫(kù)質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒、Ⅱ博士學(xué)位論文回復(fù)雜交驗(yàn)證。將獲得的真陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析和在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)。2．交聯(lián)免疫沉淀技術(shù)驗(yàn)證候選蛋白與Tiaml之間存在相互作用利用基因重組技術(shù)，分別構(gòu)建了帶有Flag和HA表位標(biāo)簽的候選蛋白和Tiaml-C1199真核表達(dá)載體。兩種載體共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293T，加入含1％甲醛的PBS交聯(lián)10min，超聲裂解獲取細(xì)胞總蛋白，將蛋白、抗體與ProteinG共同孵育，通過(guò)anti

8、-HA和anti-Flag的抗體分別進(jìn)行免疫復(fù)合物沉淀，再以anti-Flag和anti-HA抗體進(jìn)行westernblot檢測(cè)，確定Tiaml和SETDBl、ZNF307是否存在相互作用。3．肝癌組織中SETDBl的表達(dá)檢測(cè)及臨床意義利用免疫組織