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1、分類號：R65密級：公開學(xué)校代碼：11065學(xué)號：Y0115130113專業(yè)博士學(xué)位論文TGF-β受體在無功能垂體腺瘤中的表達(dá)水平與腫瘤侵襲性的關(guān)系作者姓名顧英豪指導(dǎo)教師豐育功教授主任醫(yī)師專業(yè)領(lǐng)域外科學(xué)（神經(jīng)外科）培養(yǎng)單位醫(yī)學(xué)院答辯日期2018年5月8日TGF-β受體在無功能垂體腺瘤中的表達(dá)水平與腫瘤侵襲性的關(guān)系摘要目的：垂體腺瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤之一。大多數(shù)原發(fā)性垂體腫瘤為起源于垂體前葉的良性腫瘤。垂體腺瘤根據(jù)其功能狀態(tài)分為功能型垂體腺瘤和無功能型垂體腺瘤兩類。無功能垂體腺瘤不產(chǎn)生活性激素，多數(shù)因占位效應(yīng)而產(chǎn)生臨床癥狀，如頭痛、視野缺損和垂體功能減退。盡管大多數(shù)垂體腺瘤在組
2、織學(xué)上為良性腫瘤，仍有大約25-55%的垂體腺瘤具有侵襲特性。部分無功能垂體腺瘤具有侵襲性，可侵入周圍組織。手術(shù)切除仍然是無功能垂體腺瘤的主要治療手段，然而對于侵襲性無功能垂體腺瘤而言，如腫瘤侵入海綿竇、第三腦室、斜坡等，則手術(shù)全切腫瘤困難，手術(shù)效果欠佳。無功能性垂體腺瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過程。到目前為止，垂體腺瘤的侵襲機(jī)制仍未完全認(rèn)識。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路是人體細(xì)胞信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)，參與人體許多生理過程，比如增殖、分化、遷移、細(xì)胞凋亡、間質(zhì)轉(zhuǎn)化，它的誤調(diào)節(jié)會導(dǎo)致腫瘤生長。典型的TGF-β信號系統(tǒng)開始它的生物功能通過配體與Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體（TGF-β
3、受體Ⅱ）結(jié)合，然后同Ⅰ型（TGF-β受體Ⅰ）結(jié)合形成復(fù)合體。此后，TGF-β受體Ⅱ可以磷酸化TGF-β受體Ⅰ并激活下游的Smad依賴性通路。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，TGF-β信號具有雙重作用。在正常和癌前上皮細(xì)胞中，TGF-β表現(xiàn)為腫瘤抑制作用，然而，隨后的基因和后生改變使TGF-β信號的腫瘤抑制作用轉(zhuǎn)化為腫瘤促進(jìn)作用。除此之外，腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生過多的TGF-β，從而促進(jìn)腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β受體有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3種亞型，其中Ⅰ型和Ⅱ型受體是TGF-β信號傳導(dǎo)所必需的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要介導(dǎo)TGF-β的作用，在TGF-β信號系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。有研究表明TGF-β受
4、體的不正常表達(dá)參與了腫瘤的生長與侵襲。其中，TGF-β受體Ⅱ是TGF-β信號的首要因素，TGF-β受體Ⅱ不正常表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞生長和侵襲的不受控制。TGF-β受體Ⅱ在腫瘤的形成和發(fā)育中起重要作用。TGF-β受體Ⅱ一直被認(rèn)為是一種腫瘤抑制劑，沉默或突變的TGF-β受體Ⅱ不能與抑制腫瘤細(xì)胞增殖的TGF-β1結(jié)合，這使得細(xì)胞增殖不受抑制且凋亡減少，由于其沉默或突變可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。許多研究已經(jīng)證實(shí)在正常垂體組織及垂體腺瘤中有TGF-β和TGF-β受體的表達(dá)。然而，TGF-β受體在無功能垂體腺瘤中的表達(dá)情況仍不清楚，特別是其在侵襲性無功能垂體腺瘤和非侵襲性無功能垂體腺瘤中的表達(dá)差異尚未有深入研
5、究。此外，TGF-β受體在無功能垂體腺瘤的發(fā)展及侵襲過程中的作用還沒有完全被理解。I本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR和Westernblot探索TGF-β受體在正常垂體、侵襲性無功能垂體腺瘤及非侵襲性無功能垂體腺瘤中的表達(dá)差異，并選擇增殖細(xì)胞核抗原來評估無功能垂體腺瘤的增殖能力，進(jìn)一步研究TGF-β受體Ⅱ與無功能垂體腺瘤的侵襲性之間的關(guān)系。方法：1.病人和樣本選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院在2009年1月至2012年12月期間診斷為無功能垂體腺瘤的病人。這些病人均通過臨床癥狀、垂體激素、磁共振成像（magneticresonanceimaging，MRI）和組織病理信息被確診為無功能垂體腺瘤，均接受了
6、經(jīng)蝶或開顱手術(shù)切除治療。無功能垂體腺瘤通過Knosp分級方法被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級。其中，Ⅰ、Ⅱ級無功能垂體腺瘤被定義為非侵襲性無功能垂體腺瘤，Ⅲ、Ⅳ級無功能垂體腺瘤被定義為侵襲性無功能垂體腺瘤。同時(shí)，我們收集了五位器官捐獻(xiàn)者的正常垂體前葉組織，以此作為正常對照組。2.實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)通過手術(shù)切除獲取組織標(biāo)本后置于液氮中進(jìn)行保存。提取總RNA后合成cDNA。熒光定量PCR反應(yīng)條件為50℃2分鐘，95℃2分鐘，（95℃15秒，60℃30秒）×40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為基因表達(dá)分析的內(nèi)對照。3.蛋白質(zhì)免疫印跡法從腫瘤組織中提取30ug蛋白，然后完成聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜。使用
7、5%牛血清白蛋白進(jìn)行封閉后，將PVDF分別加入TGF-β受體Ⅰ抗體（1:1000）、TGF-β受體Ⅱ抗體（1:1000）和GAPDH抗體（1:5000），在4℃環(huán)境下孵育過夜。然后，在膜上加入羊抗兔抗體進(jìn)行孵育。蛋白條帶通過ECL方法進(jìn)行顯影并立即在顯影底片上曝光。用QuantityOne軟件進(jìn)行灰度掃描，半定量測定Westernblot條帶的光密度值。4.免疫組織化學(xué)方法將所有組織進(jìn)行石蠟包埋制備石蠟標(biāo)本，并做5um厚度的連續(xù)石蠟切片。石蠟切片置入0.0
