豬輪狀病毒四川株的分離與鑒定

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)SichuanAgriculturalUniversityDISSERTATIONSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementforMASTERDEGREEIsolationandidentificationofporcinerotavirusSichuanstrainByCuitingtingDirectedbyProf．WenXintianProf．CaoSanjieProf．HuangxiaoboYa’anSichuanMay2014萬(wàn)方數(shù)據(jù)論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成

2、果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)所使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研究生簽名：礁持娉Ⅵ他年‘月脅日關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名

3、：崔娉蝽導(dǎo)師簽名：文v閉劃餌占月乜日杪l歸鈿l姐萬(wàn)方數(shù)據(jù)摘要豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PoRV)是全球養(yǎng)豬業(yè)引起仔豬腹瀉的主要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)斷奶仔豬PoRV感染也較普遍，因此開(kāi)展該病的病原分離等防控技術(shù)研究具有重要意義。本研究對(duì)2012年四川成都某豬場(chǎng)的疑似PoRV感染的腹瀉病料進(jìn)行RT．PCR檢測(cè)，再進(jìn)行了病原分離，成功分離獲得一株輪狀病毒，并對(duì)該病毒的病毒特性進(jìn)行了研究。1．病毒的分離鑒定與特性將RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的腹瀉病料處理后接種到MAl04細(xì)胞中，接毒中采用胰蛋白酶處理活化病毒的方法，60ug／ml胰酶敏化病毒液，并在維持液中

4、使胰酶終濃度為6ug／ml。接毒后第一代便開(kāi)始出現(xiàn)CPE，但不典型，到第三代時(shí)接毒第2天便開(kāi)始出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，出現(xiàn)死細(xì)胞，并且死細(xì)胞堆積到一塊；第3天出現(xiàn)明顯的病變特征，表現(xiàn)為細(xì)胞界限不清、圓縮、堆積呈菜花狀，細(xì)胞開(kāi)始脫落形成空泡區(qū)，直至第4天，大量的細(xì)胞死亡并脫落。將細(xì)胞分離病毒液連續(xù)傳至22代，每隔3代進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，表明分離出的病毒為PoRV，將其命名為SC．C。測(cè)定其TCID50表明病毒以10。。57倍稀釋后50ul接種細(xì)胞后可導(dǎo)致半數(shù)細(xì)胞死亡。理化性質(zhì)鑒定表明，該分離毒株對(duì)乙醚和氯仿均不敏感，但將其置56"C水浴30rain可將其滅活，證明其不耐熱。

5、2．VP7基因的克隆、測(cè)序與分析本研究根據(jù)GenBank中豬輪狀病毒VP7全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，對(duì)分離株的VP7進(jìn)行了全基因克隆測(cè)序與序列分析。結(jié)果表明VP7基因全長(zhǎng)1061bp，編碼326個(gè)氨基酸，核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列長(zhǎng)度與其它PoRV的VP7基因相同。將VP7序列同52株韓國(guó)分離的豬輪狀病毒毒株比較，核苷酸序列和氨基酸序列同源性都在99％以上，表明PoRV的VP7序列相對(duì)較保守。將其同其它9株G5血清型毒株進(jìn)行比對(duì)，核苷酸序列同源性為87．4％～99．8％，氨基酸序列同源性也高達(dá)92．6％～99．7％，而同其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均較低，由此可推斷出

6、，該分離株屬于G5血清型。利用生物信息學(xué)軟件VP7蛋白進(jìn)行分析，其相對(duì)分子量為37．018KD，等電點(diǎn)為4．86，不穩(wěn)定性系數(shù)為35．81，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，脂溶指數(shù)為95．06，總平均親水性為0．072。該蛋白最大疏水指數(shù)為3．678，最小疏水指數(shù)為．2．400。1萬(wàn)方數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)VP7蛋白含有9個(gè)抗原位點(diǎn)，4．23位和32．54位存在2個(gè)跨膜區(qū)，推測(cè)此結(jié)構(gòu)與VP7蛋白作為輪狀病毒的主要中和抗原相關(guān)。PredicProtein預(yù)測(cè)該VP7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中c【．螺旋占30．67％，13-折疊占32．52％，8．轉(zhuǎn)角占36．81％，其功能位點(diǎn)中包含1個(gè)N．糖基化位點(diǎn)，4個(gè)蛋白激酶C磷酸化作用位

7、點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化作用位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化作用位點(diǎn)和3個(gè)N．豆蔻酰化位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明VP7基因同國(guó)內(nèi)東北分離到的一株A組豬輪狀病毒(JL94)親緣性最近，其次與牛源A組輪狀病毒具有較近進(jìn)化距離。3．病毒回歸試驗(yàn)取3．75x106PFU／m1細(xì)胞分離PoRV病毒液感染4日齡乳豬進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，人工感染乳豬表現(xiàn)為感染3h后四處走動(dòng)、步態(tài)不穩(wěn)、拱背腹痛癥狀、呼吸急促，頻率為70次／rain，到第5天出現(xiàn)腹瀉癥狀，呈黃色水樣腹瀉