豬流行性腹瀉病毒地方株LJB03株分離鑒定

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1、摘要采用傳代細胞(非洲綠候腎細胞)從豬腹瀉糞便中分離出1株豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，命名為PEDVLJB／03株。該病毒接種Vcro細胞時，在其維持液中加入3p∥ml胰酶，通過穩(wěn)定的細胞病變、病毒的TCID50測定、RT-PCR擴增試驗、間接免疫熒光試驗、間接ELISA試驗等方法對該分離毒進行了鑒定。實驗結果表明：病毒盲傳20代，未出現(xiàn)明顯的病變，第2l代48h出現(xiàn)可見CPE，72h收獲病毒液。隨著傳代代數(shù)的增加，出現(xiàn)CPE的時間縮短，細胞病變程度亦隨之加劇。該毒株傳到40代時。接種病毒的細胞產(chǎn)生規(guī)律性病變，病毒培養(yǎng)24h，細胞腫脹

2、變圓，折光性增強，顆粒物質(zhì)增多；培養(yǎng)36h，細胞大量脫落崩解，細胞間隙變大：培養(yǎng)48h，細胞脫落達到80％，細胞拉成網(wǎng)狀，而對照細胞直到培養(yǎng)48h還保持致密的單層，呈長梭形，輪廓清晰，細胞脫落極少。為進一步證明這種病變是由PEDV所引起以及病毒在細胞中得以繁殖，本實驗以每隔10個代次采用RT-PCR技術擴增PEDVM基因，對第l、10、20、30和40不同代次的細胞培養(yǎng)物進行的RT-PCR檢測，結果均為陽性。間接免疫熒光實驗結果表明，經(jīng)PEDV感染40h后的Vero細胞，在細胞中檢測到病毒抗原的存在，可見綠色熒光，而未被PEDV感染的Vero細胞中，看不見任何綠色熒光。間接ELISA檢測，P／

3、N平均比值為7．6，判斷此細胞培養(yǎng)毒為陽性。對第40代病毒測定TCID∞結果為lO{一／0．1mL。由以上的試驗可以證明從糞便里分離出的這株病毒為豬流行性腹瀉病毒，且此病毒能在含有胰酶維持液的Vero細胞培養(yǎng)物上生長繁殖。關鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；分離；鑒定研究生學位論文獨創(chuàng)聲明和使用授權書獨創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含未獲得l逵!麴遺直墓絲重要掛型主明的：奎攔互窒2或其他教育機構的學位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢

4、獻均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。學位論文作者簽名：專長缸l'b-日期：Ⅷ眸。占月／多日學位論文版權使用授權書本學位論文作者完全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權學校可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。(保密的學位論文在解密后適用本授權書)學位論文作者簽名：弓次備L{1，導師簽名：j參一f罨=，日期：陽91年衫月，多日引言limnq●1引言豬流行性腹瀉病毒(PorcineEpidemicDiahorreaVirus，PEDV)

5、是引起豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀特征的豬腸道傳染病病原(殷震，1997；B．E．斯特勞，2000)，不同年齡和不同品種的豬均易感，但對哺乳仔豬的危害最為嚴重(TimoneyJ．F．etal，1988)，死亡率最高可達10096。自從1971年英國首次報道豬流行性腹瀉(PED)以來(PensaertMB，1978)，相繼在比利時、德國、加拿大、日本、瑞士等多個國家報道了本病的發(fā)生(DeBouckP，1980；DucatelleR，1981；TakahashiK，1983)，我國從1976年開始就陸續(xù)有PED的報道(蔡寶祥，1982；倪艷秀，2001)。本病己成為重要的豬病毒性腹瀉病之一，1

6、991年國際病毒分類委員會(ICTV)第五次報告將PED列為冠狀病毒屬的可能成員，1995年第六次報告將其列為冠狀病毒屬的正式成員(MurhyFA。1995)。由于PEDV適應細胞培養(yǎng)難度高，自70年代初發(fā)現(xiàn)以來，曾用各種方法試圖把病毒適應于細胞培養(yǎng)，進行體外擴增，先后以多種細胞進行培養(yǎng)實驗，但是一直沒有獲得成功，成為病毒學上的一道難題。直到1988年瑞典Hoffinan等首次在VeTo傳代細胞的培養(yǎng)液中加入胰酶，病毒培養(yǎng)獲得成功，連續(xù)傳5代出現(xiàn)細胞病變(Hofinann,Met也1998)，其次日本和韓國也相繼報道PEDV在VeTo細胞上的培養(yǎng)特性(DS，Song,2003；WZhangct

7、al，1996)。針對PEDV適應細胞培養(yǎng)難度高的特點，本研究通過在VeTo傳代細胞培養(yǎng)液中加入胰酶的方法，從豬腹瀉糞便中分離出1株豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)，并命名為LJB／03。通過穩(wěn)定的細胞病變、病毒的TCID50測定、RT-PCR擴增試驗、間接免疫熒光試驗、間接競爭ELISA試驗等方法對該分離毒進行鑒定。試驗表明：此分離株為豬流行