水通道蛋白3與人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的機(jī)制研究

水通道蛋白3與人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的機(jī)制研究

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1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)中圖分類號(hào)UDCR75610博士學(xué)位論文學(xué)校代碼!Q§圣三密級(jí)公玨水通道蛋白3與人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的機(jī)制研究MechanisticStudyofAquaporin3inPhotoagingofNormalHumanSkinFibroblasts作者姓名:學(xué)科專業(yè):研究方向:學(xué)院(系、所):指導(dǎo)教師:副指導(dǎo)教師:劉芳芬臨床醫(yī)學(xué)皮膚病與性病學(xué)湘雅醫(yī)院謝紅付教授李吉副研究員論文答辯日期絲墾:!!!!答辯委員會(huì)主席顯幺中南大學(xué)二。一三年十一月萬(wàn)方數(shù)據(jù)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明lItllllllllllllltlllt

2、HMtllllltllY2686023本人鄭重聲明,所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知,除了論文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外,論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果,也不包含為獲得中南大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我共同工作的同志對(duì)本研究所作的貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明。申請(qǐng)學(xué)位論文與資料若有不實(shí)之處,本人承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。作者簽名:立陣曰期:業(yè)年旦月蘭日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者和指導(dǎo)教師完全了解中南大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定:

3、即學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版;本人允許本學(xué)位論文被查閱和借閱;學(xué)校可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,可以采用復(fù)印、縮印或其它手段保存和匯編本學(xué)位論文。保密論文待解密后適應(yīng)本聲明。作者簽名:?jiǎn)稳掌冢后?≥年L月型日導(dǎo)師簽名:萬(wàn)方數(shù)據(jù)本課題受以下基金資助:國(guó)家自然科學(xué)基金(NO.81271775,81171520),中國(guó)高等院校博士學(xué)科點(diǎn)科研基金(20100162l10035),中國(guó)博士后科學(xué)基金(2012M511421),湖南省科學(xué)技術(shù)廳科研基金(20l2W

4、K3045).萬(wàn)方數(shù)據(jù)中南大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要水通道蛋白3與人皮膚成纖維細(xì)胞光老化的機(jī)制研究摘要:水通道蛋白3(Aquaporin3,AQP3)是一種能快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和尿素等小分子物質(zhì)的膜整合蛋白,在皮膚的屏障功能、水的保存中起重要作用。AQP3不但參與細(xì)胞的增殖、分化與遷移,與皮膚細(xì)胞的衰老相關(guān),而且還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)H:0:的透膜吸收,進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的異化途徑,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),參與衰老以及與衰老相關(guān)的各種生理病理過(guò)程。但隨著年齡的增長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)自噬功能逐漸減弱,導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)外

5、界環(huán)境和自身防御反應(yīng)的能力降低,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞光老化過(guò)程中,UVA輻射細(xì)胞產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)自噬及細(xì)胞衰老,而衰老的細(xì)胞中,自噬功能減弱,ROS對(duì)細(xì)胞造成的損傷得不到清除而不斷積累,進(jìn)一步加重細(xì)胞衰老。而H:0:作為ROS的重要組成成分,可被AQP3跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),由此,我們推測(cè):AQP3與自噬在NHSFs光老化過(guò)程中可能存在某些聯(lián)系。本研究的第一部分中,我們首先采用組織塊真表皮分離法原代培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細(xì)胞(NHSFs),利用320-400nm波長(zhǎng)范圍的UVA輻射NHSFs,構(gòu)建光老化細(xì)胞模型。再行慢病毒

6、轉(zhuǎn)染AQP3shRNA和AQP3cDNA質(zhì)粒,成功構(gòu)建不同AQP3表達(dá)量的NHSFs穩(wěn)定細(xì)胞株。最后行B一半乳糖苷酶染色、Western-blot(wB)和RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)衰老相關(guān)指標(biāo)及光老化過(guò)程中AQP3水平的變化;行透射電鏡、免疫熒光染色(IF)以及Western—blot等技術(shù)檢測(cè)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn):(1)小劑量UVA單次輻射NHSFs,不能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,但AQP3表達(dá)增高;小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,此時(shí)AQP3表達(dá)下降;(2)降低表達(dá)AQP3的NHSFs出現(xiàn)衰老表型,接受小

7、劑量的UVA單次輻射可加重衰老;而過(guò)表達(dá)AQP3可使NI-ISFs在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的衰老減輕;(3)小劑量UVA單次輻射NHSFs,細(xì)胞自噬水平增高;小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,自噬水平下降;(4)降低表達(dá)AQP3的NHSFs,自噬水平降低,小劑量的UVA單次輻射可使自噬水平進(jìn)一步降低;而過(guò)表達(dá)AQP3,使NHSFs的白噬水平增加,在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的亦可減輕萬(wàn)方數(shù)據(jù)中南大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要白噬水平的降低。該部分研究初步明確了,AQP3通過(guò)影響細(xì)胞白噬,在人皮

8、膚成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中的發(fā)揮保護(hù)性作用。為進(jìn)一步明確AQP3通過(guò)影響自噬參與細(xì)胞光老化過(guò)程的具體機(jī)制,在第二部分的研究中,我們利用前期構(gòu)建的光老化細(xì)胞模型和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,使用H20。抑制劑,以及三條MAPKs途徑中各磷酸化蛋白分子的抑制劑,檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)H:0:水平,以及ERKl/2/、JNK/SAPK、p38MAPK及mTOR磷酸化水平/總蛋白水平以及LC3II/I

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