釉原蛋白對(duì)mdpc-23細(xì)胞分化影響實(shí)驗(yàn)的研究-

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1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文*釉原蛋白對(duì)MDPC-23細(xì)胞分化影響的實(shí)驗(yàn)研究摘要成牙本質(zhì)細(xì)胞分化是牙髓組織自身?yè)p傷修復(fù)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是牙胚發(fā)育的重要階段，這一過(guò)程受多種因子的調(diào)控，尋找誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的因子并闡明其誘導(dǎo)機(jī)制，一直是牙髓生物學(xué)的研究熱點(diǎn)，也是認(rèn)識(shí)牙髓損傷修復(fù)過(guò)程、形成治療新靶點(diǎn)的關(guān)鍵。目前已發(fā)現(xiàn)多種細(xì)胞外基質(zhì)分子及其受體、生長(zhǎng)因子及受體、同源異形盒基因、原癌基因及轉(zhuǎn)錄因子、維甲酸及其受體、細(xì)胞粘附分子等參與成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化，其中，生長(zhǎng)因子及其受體參與細(xì)胞調(diào)控、分化的研究始終是生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。釉

2、原蛋白(Amelogenin，AMG)是成釉細(xì)胞分泌的一組同源性的低分子量(20～30KD)的疏水蛋白，富含脯氨酸、谷氨酰胺和組胺酸，是釉基質(zhì)蛋白的主要成分，約占90％，它在牙齒發(fā)育的各個(gè)階段均有表達(dá)，以往對(duì)于釉原蛋白的研究主要集中于其在牙胚發(fā)育中的表達(dá)、對(duì)釉質(zhì)發(fā)育形成的作用及其在牙周組織再生中的作用。2005年Tompkins等報(bào)道純化的大鼠釉原蛋白可促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠牙胚中的成牙本質(zhì)細(xì)胞的成熟，這提示釉原蛋白可能能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化成熟。本研究旨在觀察小鼠釉原蛋白對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23分

3、化的影響及其機(jī)制，研究釉原蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞存活，增殖和分化的影響，進(jìn)一步研究其對(duì)MAPKs各通路蛋白磷酸化的影響，并應(yīng)用MAPKs抑制劑和釉原蛋白聯(lián)合作用，特異性阻斷各MAPKs通路，觀察釉原蛋白誘導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的影響。為研究牙齒損傷修復(fù)過(guò)程中釉原蛋白參與成牙本質(zhì)細(xì)胞分化過(guò)程的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：1.首先我們從MDPC-23細(xì)胞克隆到了小鼠的釉原蛋白基因，全長(zhǎng)591bp，Genbank登錄號(hào)為NM009666，同時(shí)設(shè)計(jì)了干涉釉原蛋白的序列，在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了能高效過(guò)表達(dá)釉原

4、蛋白和干涉釉原蛋白的重組腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及對(duì)照腺病毒Ad-EGFP載體，進(jìn)行病毒擴(kuò)增和滴度測(cè)定，并感染MDPC-23細(xì)胞檢測(cè)其表達(dá)及干涉效果，結(jié)果表明：構(gòu)建的腺病毒載體能夠正確地表達(dá)釉原蛋白或干涉其表達(dá)。2.腺病毒感染MDPC-23細(xì)胞后光鏡觀察表明，過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23*資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（NO.30973334）5第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞形成較長(zhǎng)的突起，胞體相對(duì)縮小，表明細(xì)胞分裂活動(dòng)變得旺盛，干涉釉原蛋白對(duì)MDPC-23細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)和流

5、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)釉原蛋白抑制了MDPC-23細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，而干涉釉原蛋白則促進(jìn)了MDPC-23細(xì)胞的增殖，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例升高，S期比例下降，而干涉釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的G1期比例降低，S期升高。堿性磷酸酶（Alkalinephosphatase，ALP)是成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的一個(gè)重要指標(biāo)，因此，檢測(cè)ALP活性的變化可以反應(yīng)細(xì)胞的分化狀態(tài)，通過(guò)ALP活性和礦化結(jié)節(jié)形成檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)釉原蛋白后，MDPC-23細(xì)胞的ALP活性顯著增高，礦化能力增強(qiáng)。R

6、T-PCR結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)釉原蛋白后，成牙本質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物DMP-1和DSPP的表達(dá)升高。相反，干涉釉原蛋白導(dǎo)致MDPC-23細(xì)胞的ALP活性降低，礦化能力減弱，DMP-1和DSPP的表達(dá)下降，Western結(jié)果表明，釉原蛋白促進(jìn)MDPC-23細(xì)胞分化主要是通過(guò)ERK1/2andp38通路起作用的。3.為研究釉原蛋白誘導(dǎo)MDPC-23細(xì)胞分化的分子機(jī)制，我們采用了基因表達(dá)譜芯片篩選MDPC-23細(xì)胞分化的差異基因，如果實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光染料的cy5/cy3比值在2.0以上，就判斷為上調(diào)基因；如果實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組熒光染料

7、的cy5/cy3比值在0.5以下，就判斷為下調(diào)基因，依此標(biāo)準(zhǔn)共獲得上調(diào)與下調(diào)的基因數(shù)目分別為1140和487。其中，有些變化的基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bonemorphogeneticprotein7,BMP-7)、神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(Neuralcelladhesionmolecules,NCAMs)、細(xì)胞周期依賴蛋白激酶2(cyclin-dependentkinase2,Cdk2)等都可能與釉原蛋白誘導(dǎo)的MDPC-23細(xì)胞分化相關(guān)，下一步擬用定量PCR的方法驗(yàn)證差異基因的變化情況，并進(jìn)行相應(yīng)的功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，綜上所述，我

8、們的結(jié)果提示釉原蛋白在體外能夠促進(jìn)成牙本質(zhì)細(xì)胞系MDPC-23的分化成熟，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。研究結(jié)論：1．克隆到了小鼠的釉原蛋白基因，全長(zhǎng)591bp，構(gòu)建了能高效過(guò)表達(dá)釉原蛋白和干涉釉原蛋白的重組腺病毒(Ad-AMG、Ad-shAMG)及對(duì)照腺病毒Ad-EGFP載體，構(gòu)建的腺病毒載體能夠正確地表達(dá)釉原蛋白或干涉其表達(dá)。2．過(guò)