超排卵周期生長(zhǎng)分化因子9和生長(zhǎng)分化因子9b表達(dá)及調(diào)控的研究

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1、學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：皇篁蘭牢日期：2。11年5月1。日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等

2、復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文，并編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)。保密囹，在—三年解密后適用本授權(quán)書。本論文屬于不保密口。(請(qǐng)?jiān)谙鄬?duì)應(yīng)的方框內(nèi)打“√”)學(xué)位論文作者簽名：皇：紐日期：2。11年5月1。日導(dǎo)師簽名：雄日期：2。··年5月·。日天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文中文摘要輔助生殖技術(shù)(AI盯)尤其是體外受精．胚胎移植(IVF．ET)的開展和成熟是治療不孕、不育癥最為行之有效的手段。控制性超排卵是IVF—ET妊娠率逐步提高的原因之一，然而不同個(gè)體的卵巢對(duì)外源性促性腺激素(Gn)

3、有不同的反應(yīng)。卵巢低反應(yīng)的發(fā)生率約為12％～30％，以超排卵后獲卵數(shù)目少和血雌二醇(E2)峰值低為特征，常導(dǎo)致治療周期取消和低妊娠率，甚至部分患者只能選擇贈(zèng)卵。因此如何評(píng)估和改善超排卵周期卵巢低反應(yīng)是IVF工作中亟待解決的難題。生長(zhǎng)分化因子．9(GDF．9)、GDF一9B作為卵源性生長(zhǎng)因子近年來(lái)被發(fā)現(xiàn)可能是卵泡發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控因子，二者隸屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子．B(TGF．p)家族，通過(guò)自分泌及旁分泌方式作用于卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞，調(diào)節(jié)卵巢局部細(xì)胞的分化、增殖，調(diào)控優(yōu)勢(shì)卵泡的形成及卵母細(xì)胞的成熟

4、。研究GDF．9、GDF．9B表達(dá)與超排卵卵巢低反應(yīng)的關(guān)系及調(diào)控機(jī)制，為臨床改善卵巢功能、提高獲卵率提供理論依據(jù)。第一部分GDF-9、GDF-9B表達(dá)與卵巢低反應(yīng)的關(guān)系目的：研究超排卵周期GDF．9、GDF．9B表達(dá)與卵巢低反應(yīng)的關(guān)系，探討二者是否參與卵巢低反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制。方法：選取行ⅣF．ET的患者70例，采用常規(guī)長(zhǎng)方案進(jìn)行超排卵，依據(jù)取卵時(shí)獲得平均直徑>14ram的卵泡數(shù)分為卵巢低反應(yīng)組21例，正常反應(yīng)組25例，高反應(yīng)組24例。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real．timePCR)技術(shù)檢測(cè)卵巢

5、不同反應(yīng)組患者卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞GDF．9mRNA、GDF．9BmRNA的表達(dá)，分析GDF．9和GDF．9B與卵巢低反應(yīng)的關(guān)系，以及二者與超排卵獲卵數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果：卵巢不同反應(yīng)組患者年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH、E2、LH水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>O．05)。卵巢低反應(yīng)組卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞的GDF．9mRNA相對(duì)表達(dá)量低于正常反應(yīng)組及高反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P

6、胞、卵丘顆粒細(xì)胞GDF．9、GDF．9BmRNA相對(duì)表達(dá)量作相關(guān)分析，GDF．9相對(duì)表達(dá)量與超排卵獲卵數(shù)呈正相關(guān)，而GDF．9B相對(duì)表達(dá)量與獲卵數(shù)呈負(fù)相關(guān)(，．分別為0．685、0．648；．0．737、．0．601，均P<0．001)。第二部分人GDF-9基因真核表達(dá)及純化目的：構(gòu)建人GDF．9真核表達(dá)載體，在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系誘導(dǎo)表達(dá)，并純化獲得GDF．9重組蛋白。方法：以eDNA克隆為模板PCR法擴(kuò)增人GDF．9基因，將所得基因片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3．1(+)，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pc

7、DNA3．I(+)／GDF．9；重組質(zhì)粒以脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)，免疫親和層析法純化目的蛋白。結(jié)果：陽(yáng)性克隆質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序結(jié)果證明pcDNA3．I(+)／GDF．9重組真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，Westernblotting確證純化重組GDF．9蛋白成功獲得。第三部分重組蛋白GDF-9對(duì)小鼠超排卵的影響目的：通過(guò)體內(nèi)動(dòng)物模型觀察重組蛋白GDF．9對(duì)小鼠超排卵的影響，深入分析GDF．9對(duì)卵泡發(fā)育的作用。方法：選取30只性成熟雌性KM小鼠隨機(jī)分配為三組，每組10只。第1組對(duì)照組小鼠

8、腹腔注射等體積生理鹽水；第2組HMG組注射HMGl0IU；第3組聯(lián)合組注射HMG10IU聯(lián)合重組蛋白GDF．910lxg；48h后三組30只小鼠均予注射HCGl0IU。注射HCG后16"-'20h處死小鼠，比較各組小鼠卵巢指數(shù)(卵巢重量／體重)及獲卵數(shù)目，ELISA法檢測(cè)血清雌二醇含量，并對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精觀察各組受精情況。結(jié)果：HMG組、重組蛋白GDF．9聯(lián)合HMG組獲卵數(shù)、超排后卵巢指數(shù)、血清雌二醇含量均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義護(hù)<0．05)，尤以聯(lián)合組獲