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《小鼠胚胎干細(xì)胞的體外標(biāo)記、誘導(dǎo)分化及顱內(nèi)移植研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、天津醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文小鼠胚胎干細(xì)胞的體外標(biāo)記、誘導(dǎo)分化及顱內(nèi)移植研究姓名：卓杰申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)外科指導(dǎo)教師：楊樹源2003.5.1摘要小鼠胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell，ES)源自發(fā)育3．5天囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，它具有全能性的分化能力和無限的自我更新能力。在體外培養(yǎng)條件下，ES細(xì)胞可以分化成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的所有細(xì)胞類型，是細(xì)胞替代性治療中理想的供體細(xì)胞。Es細(xì)胞能夠在體外長期培養(yǎng)和增殖，是進(jìn)行基因修飾的良好平臺。在本實驗中，我們采用EGFP基因作為標(biāo)記基因，通過隨機(jī)整合的方式獲得了EGFP基因普遍表達(dá)，能夠發(fā)出綠色熒光，并保持ES細(xì)胞特性的細(xì)胞系；綠色熒光在轉(zhuǎn)化細(xì)
2、胞進(jìn)行體外培養(yǎng)、傳代和分化時仍能夠穩(wěn)定表達(dá)。將該Es細(xì)胞系懸浮培養(yǎng)時，可以聚集成類胚體(embryonicbody，EB)。在類胚的培養(yǎng)體系中加入視黃酸(retinoicacid，RA)誘導(dǎo)(4一／4+法)后，EB可以再次貼壁生長，大部分細(xì)胞伸展、分化成神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)，而且分化后的細(xì)胞仍然可以發(fā)出綠色熒光，所以這種經(jīng)EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系是研究ES細(xì)胞體內(nèi)外分化、移植和干細(xì)胞治療的一個良好工具。我們利用自由落體法構(gòu)建了大鼠的機(jī)械性顱腦損傷模型，在傷后的24h內(nèi)，將EGFP標(biāo)記的小鼠ES細(xì)胞植入到了腦損傷區(qū)。連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)：移植的Es細(xì)胞主要集中在腦損傷區(qū)，損傷區(qū)局部有大量的膠質(zhì)細(xì)
3、胞和纖維增生，這些增生的膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)纖維對ES細(xì)胞有阻斷作用，故電鏡下只見到ES細(xì)胞間對接，而宿主神經(jīng)元和移植的ES細(xì)胞間沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞連接。在所有接受ES細(xì)胞移植的大鼠(n=44)中，有4例在移植部位的頭皮下長出實體性腫物，冰凍切片上，源自這些腫物的細(xì)胞均能發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光；經(jīng)病理學(xué)診斷證實，一例與人類的毛細(xì)胞性星型細(xì)胞瘤相符；另一例則符合PNETs(原始神經(jīng)上皮性腫瘤一髓母細(xì)胞瘤)的表現(xiàn)；另81"2例的病理表現(xiàn)符合結(jié)節(jié)性肉芽腫(典型的免疫排斥反應(yīng)表現(xiàn))，不僅如此在所有的移植部位都可以見到有明顯的免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。關(guān)鍵詞：胚胎干細(xì)胞系，EGFP基因，細(xì)胞分化，腦外傷，移植ABSTRACTM
4、ouseembryonicstem(ES)celllines，denvedfromtheinnercellmassof3．5dayblastocysts，aretotipotentandhavetheabilitytounlimiUyself-renew．EScellcanbeinducedtodifierentiatedintoalItissues．includinggermlinecells／nvitro．Theyarethebestcandidatedonorforcellreplacementtherapy．EScelllinecanbemaintainedandproliferate
5、dpermanently『門vitro,sotheyarefavorableforgenetransduction．Inthisstudy，weusedEGFPgeneasreportgene．a(chǎn)ndlabeledEScellwithitrandomly．EGFPexpressing(greenfluorescence)EScellswithnomalproperties，such髂viabilityanddifferentiationability，weresuccessfullygenerated．ThegreenflurescenceofEGFPexpressingcellsmainta
6、inedinpropagatingtheEScellsforlongterrnandindifferetiatedcells．Culturedinsuspension．the”green。。ESceilswereaggregatedandformedembryoidbodies．Afteraddingretinoicacid(RA)intheEBculturesystem(4-，4+)，theycouldre·adheretothebottomoftheplasticfoster，mostoflhemspreadedanddifferetiatedintoneuralceilsfsuchasn
7、euron，astrocytes)，andthepost—differetiatedcellsemittedgreenfluorescenceaswell．SO廿1eEGFPexpressingEScellsholdgreatflexibilityforthestudyofcelldifferetiation，transplantationandstemcelltherapy．1nthisstud
