茶樹(shù)4cl基因的克隆及功能驗(yàn)證

《茶樹(shù)4cl基因的克隆及功能驗(yàn)證》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲巧所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究＇工作及取。據(jù)我所知，論得的研究成果，除了文中特別加臥標(biāo)注和致謝的地方外文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研巧成果，也不包含為獲得安徽一農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明滿的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名；寺?tīng)枲枺崳姾炞衷黄冢号d護(hù)豐＾月０曰／學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論義的復(fù)印件和電子

2、文件允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可將學(xué)位論文的全部＾、或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可１＾１采用影印縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)）。：學(xué)位論文作者簽名；古爾爾指導(dǎo)教師簽名簽字曰期：：＞狂年右月Ｃ舊簽字曰期妙狂年＾月｜０與／：學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向工作單位：電話：：通信地址：郵編；＊摘要在植物體內(nèi)，苯丙烷代謝是一條重要的次生代謝途徑，涉及到木質(zhì)素、黃酮類化合物以及花青素等多種代謝產(chǎn)物的生物合成。4香豆酸輔酶A連接酶（4CL）處于苯丙烷

3、代謝途徑與木質(zhì)素合成以及類黃酮途徑結(jié)合的分支點(diǎn)上，對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要的調(diào)控作用。本研究克隆了2條茶樹(shù)4CL基因（Cs4CL）；利用原核表達(dá)技術(shù)、HPLC和UPLC-MS鑒定技術(shù)以及紫外分光光度檢測(cè)技術(shù)，驗(yàn)證了融合蛋白Cs4CL的功能；構(gòu)建Cs4CL植物過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化了煙草和擬南芥。主要研究結(jié)果如下：1．從NCBI和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中篩選出兩條Cs4CL基因的EST序列，利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆得到茶樹(shù)兩條Cs4CL基因。利用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cs4CL1和Cs4CL2的氨基酸一致性為62.63%，它們都具

4、有植物4CL蛋白高度保守的基序BoxI和BoxII。對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)兩條Cs4CL基因分別屬于兩個(gè)不同的亞組。2.利用原核表達(dá)體系，對(duì)Cs4CL1和Cs4CL2進(jìn)行了原核表達(dá)。構(gòu)建了petSUMO-Cs4CL1和petSUMO-Cs4CL2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Escherichiacoli.BL21表達(dá)菌株。誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)Cs4CL1與Cs4CL2融合蛋白進(jìn)行了分離純化，得到重組蛋白。利用HPLC及UPLC-MS檢測(cè)技術(shù)，對(duì)Cs4CL1與Cs4CL2融合蛋白進(jìn)行酶活檢測(cè)及產(chǎn)物鑒定，發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白均具有催化活性。3．利用紫外分光光度檢測(cè)技術(shù)，研究了Cs4

5、CL1與Cs4CL2重組蛋白的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，酶的穩(wěn)定特征，以及底物特異性。結(jié)果表明：Cs4CL1的最適反應(yīng)pH為6.5，最適溫度為50℃；最適穩(wěn)定溫度為0℃，pH為7.0；最適底物為咖啡酸。Cs4CL2最適反應(yīng)pH為7.5，最適溫度為50℃；最適穩(wěn)定溫度為-20℃，pH為6.0；最適底物為香豆酸。4．構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體pCB2004-Cs4CL1和pCB2004-Cs4CL2，對(duì)其進(jìn)行煙草的遺傳轉(zhuǎn)化。同時(shí)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體pGWB5-Cs4CL1和pGWB5-Cs4CL2，進(jìn)行擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化，PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，目的基因Cs4CL1以及Cs

6、4CL2均已成功轉(zhuǎn)入煙草和擬南芥中。關(guān)鍵詞:茶樹(shù)，4CL，原核表達(dá)，遺傳轉(zhuǎn)化，功能分析AbstractPhenylpropanoidmetabolicpathwayisanimportantsecondarymetabolicpathwayinplant,whichinvolvedinthebiosynthesisoflignin,flavonoidsandanthocyanins.P-coumaricacidcoenzymeAligase(4CL)isthelastenzymeofphenylpropanoidpathwaywhichlocatedin

7、thebranchofthephenylpropanoidpathway,ligninproductionandflavonoidspathway.Itplaysanimportantroleinthesecondarymetabolitespathwayinplant.Inthispaper,weclonedtwo4CLgenesinteaplant(Cs4CL);throughprokaryoticexpressiontechnique,HPLCtechnology,UPLC-MStechnologyandspectrophotometricassa

8、ys,weidentifiedthefunctionofHfusionHHpro