資源描述：
《orfv感染宿主細(xì)胞的mrna表達(dá)譜變化及其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、中文摘要ORFV感染宿主細(xì)胞的mRNA表達(dá)譜變化及其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬機(jī)制的研究羊傳染性膿皰病毒（Orfvirus，ORFV）是痘病毒科副痘病毒屬的代表種，具有嗜上皮性，綿羊、山羊以及人發(fā)生感染后通常在口、唇等部位皮膚出現(xiàn)丘疹、膿皰等損傷性病變，因此該病又俗稱為“羊口瘡”（Orf）。Orf作為一種人獸共患傳染病，對(duì)人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前，該病的發(fā)生、流行均呈上升趨勢(shì)。宿主感染譜也在逐漸擴(kuò)大，除感染中小反芻動(dòng)物外，也不斷有野生動(dòng)物發(fā)生感染的報(bào)道。近年來(lái)，研究者對(duì)ORFV的基因組結(jié)構(gòu)、免疫特性以及載體應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量的研究；然而，目前仍沒(méi)有有效預(yù)防
2、和治療羊傳染性膿皰病的方法和措施。病毒的感染和致病是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，病毒侵染宿主后能夠引起易感細(xì)胞的一些調(diào)控基因差異表達(dá)及其所介導(dǎo)信號(hào)通路改變，造成細(xì)胞生理功能異常從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本項(xiàng)目從病毒與宿主相互作用的角度入手，利用Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)構(gòu)建羊源原代胚胎鼻甲（ovinefetalturbinate，OFTu）細(xì)胞感染ORFV后48h和96h的mRNA表達(dá)譜，進(jìn)行差異表達(dá)基因的篩選。在感染病毒后48h，篩選得到了1047個(gè)表達(dá)上調(diào)基因，366個(gè)表達(dá)下調(diào)基因；在感染病毒后96h，有1570個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，982個(gè)基因表
3、達(dá)下調(diào)；GO分析結(jié)果表明，差異基因參與的分子功能主要有催化活性、結(jié)合活性、酶調(diào)節(jié)活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等；參與的生物學(xué)過(guò)程主要有免疫過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、代謝過(guò)程和應(yīng)激反應(yīng)等。Pathway分析結(jié)果顯示，所篩選得到的差異表達(dá)基因主要參與炎癥、免疫、細(xì)胞自噬以及細(xì)胞凋亡等相關(guān)通路。該部分研究結(jié)果將為針對(duì)ORFV與宿主互作研究的開(kāi)展提供重要的理論依據(jù)，并為進(jìn)一步揭示ORFV致病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。近年來(lái)，許多研究已經(jīng)證實(shí)自噬和病毒感染之間具有直接的作用關(guān)系。然而，ORFV是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬卻并未見(jiàn)有報(bào)道。我們前期研究對(duì)ORFV感染前后差
4、異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選鑒定，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞自噬相關(guān)的差異表I達(dá)基因如自噬標(biāo)志性分子LC3表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞自噬是機(jī)體一種非常重要的保護(hù)和防御機(jī)制，能夠?qū)⑹軗p細(xì)胞器、胞質(zhì)內(nèi)容物進(jìn)行循環(huán)再利用，為細(xì)胞提供合成底物和能量來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。因此，我們選擇在生理和病理以及先天性免疫和獲得性免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用的自噬作為研究方向。本研究在ORFV感染OFTu細(xì)胞或Hela細(xì)胞后，利用透射電鏡、間接免疫熒光和免疫印跡分別進(jìn)行了自噬體形態(tài)學(xué)觀察、內(nèi)源性LC3的定位以及LC3的型別轉(zhuǎn)換的檢測(cè)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ORFV能夠誘導(dǎo)OFTu細(xì)胞和Hela細(xì)胞自噬體的形成。因?yàn)?/p>
5、自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程不僅包括自噬體的形成，而且還包括自噬體與溶酶體融合運(yùn)送被降解物到自噬溶酶體降解的過(guò)程。因此我們又進(jìn)一步通過(guò)免疫印跡對(duì)自噬底物SQSTMl/p62進(jìn)行了檢測(cè)；結(jié)果顯示，ORFV感染宿主細(xì)胞（OFTu細(xì)胞和Hela細(xì)胞）后能夠誘導(dǎo)自噬體和溶酶體融合進(jìn)而降解自噬底物。在證實(shí)ORFV能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完整的自噬過(guò)程后，本研究用自噬誘導(dǎo)劑（Rapa或EBSS）以及自噬不同時(shí)期（早期抑制劑3-MA和晚期抑制劑CQ）的抑制劑處理宿主細(xì)胞后，接種ORFV，利用免疫印跡對(duì)LC3的型別轉(zhuǎn)換進(jìn)行了檢測(cè)。在有效誘導(dǎo)或抑制自噬后，檢測(cè)ORFV的感染滴度。結(jié)
6、果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)自噬或抑制自噬后，ORFV的感染滴度并未發(fā)生明顯變化。這可能是宿主在ORFV入侵時(shí)激活了自噬過(guò)程進(jìn)行自我保護(hù)，而ORFV可能也會(huì)編碼一些蛋白來(lái)逃避或抵御宿主抗病毒反應(yīng)。為了進(jìn)一步明確ORFV感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬的機(jī)制。本研究在ORFV感染細(xì)胞或Rapamycin處理細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行了免疫印跡分析；結(jié)果顯示，ORFV感染組以及Rapamycin處理組的mTOR的磷酸化水平降低，而LC3-Ⅱ的表達(dá)量顯著升高，說(shuō)明mTOR信號(hào)途徑在ORFV誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程中具有重要的作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證mTOR途徑的抑制是ORFV誘導(dǎo)自噬的關(guān)鍵步驟
7、，我們對(duì)Rheb基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后構(gòu)建了能夠激活mTOR活性的Rheb激活形式：pCMV-myc-RhebQ64L過(guò)表達(dá)載體。將pCMV-myc-RhebQ64L轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，進(jìn)行免疫印跡分析；結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染RhebQ64L后mTOR的磷酸化水平明顯升高，而LC3-Ⅱ表達(dá)量下降；說(shuō)明RhebQ64L恢復(fù)了mTOR的活性。在證實(shí)ORFV能夠通過(guò)抑制mTOR途徑誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后，我們對(duì)mTOR上游的Erk1/2和TSC2的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ORFV能夠激活TSC2和Erk1/2的活性。II用U0126（Erk1/2抑制劑）處理Hela細(xì)胞后，接種病毒，
8、免疫印跡分析mTOR、Erk1/2以及TSC2的磷酸化水平；結(jié)果顯示，p-Erk1/2和LC3-Ⅱ的表達(dá)量明
