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《蟲草素生物合成相關(guān)基因RNR的克隆及功能驗證研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、（藥學(xué)院）二○一八屆碩士研究生學(xué)位論文蟲草素生物合成相關(guān)基因RNR的克隆及功能驗證研究CloningandFunctionalVerificationofRNRGeneRelatedtoCordycepinBiosynthesis研究生姓名：王玉賢指導(dǎo)教師：國錦琳教授學(xué)科專業(yè)：生藥學(xué)二○一八年五月成都中醫(yī)藥大學(xué)（藥學(xué)院）二0一八屆碩士研究生學(xué)位論文蟲草素生物合成相關(guān)基因RNR的克隆及功能驗證研究CloningandFunctionalVerificationofGenesRelatedtoCordycep
2、inBiosynthesis研究生姓名：王玉賢指導(dǎo)教師：國錦琳教授學(xué)科專業(yè)：生藥學(xué)二○一八年五月學(xué)位論文蟲草素生物合成相關(guān)基因的克隆與功能驗證研究CloningandFunctionalVerificationofGeneRelatedtoCordycepinBiosynthesis王玉賢指導(dǎo)教師姓名：國錦琳教授申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)名稱：生藥學(xué)論文提交時間：2018.5論文答辯時間：2018.5.25二○一八年五月本研究在國家自然科學(xué)基金（No.81373920）、四川省中醫(yī)管理局川產(chǎn)道地藥材大品種項目
3、、成都市科技計劃項目(2015-HM01-00205-SF)資助下完成。成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2018屆碩士研究生學(xué)位論文摘要蟲草是蟲草屬（Cordyceps（Fr.）Link）真菌寄生于昆蟲、蜘蛛和大團囊菌屬（ElaphomycesNees&Fr.）的某些地下種類上，在一定的條件下形成子實體而呈現(xiàn)的蟲菌復(fù)合體，冬蟲夏草和蛹蟲草是蟲草的典型代表。冬蟲夏草（Cordycepssinensis）是我國傳統(tǒng)名貴中藥，蛹蟲草（Cordycepsmilitaris（Fr.）Link）具有與其相似的藥用價值，蟲草素為兩
4、者有效成分之一，也是第一個從真菌里發(fā)現(xiàn)的核苷類抗菌素，具有很強的抗菌、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及抗炎等作用，有良好的臨床應(yīng)用前景。一直以來，蟲草素的藥理作用是研究的熱點，但由于其含量低、提取效率不高，難以大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。揭示蟲草素生物合機制，采用合成生物學(xué)等方法高效獲得蟲草素是當下的研究熱點和出路。本研究以課題組前期對冬蟲夏草子實體轉(zhuǎn)錄組分析預(yù)測的蟲草素合成途徑及挖掘到的關(guān)鍵酶核糖核苷酸還原酶—RNR為研究對象，對冬蟲夏草RNR大小亞基進行cDNA克隆，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化蛹蟲草菌探究其與蟲草素合成的關(guān)系。
5、由于冬蟲夏草生長周期長，生長條件特殊，尚無成功構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系的報道，而蛹蟲草菌遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建研究相對成熟，且冬蟲夏草RNR大小亞基與蛹蟲草菌RNRL（GI：573978269）和RNRM（GI：573986094）氨基酸序列相似率分別為99%和97%，冬蟲夏草和蛹蟲草RNR大小亞基序列高度保守，故本實驗選用蛹蟲草菌構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化體系，對蟲草素合成的關(guān)鍵酶RNR進行功能驗證。利用PCR技術(shù)克隆冬蟲夏草子實體RNR的大小亞基基因cDNA全長。RNRL和RNRM基因末端分別加入FLAG標簽，并在基因兩端設(shè)計添
6、加相應(yīng)的酶切位點，利用分子生物學(xué)方法，成功構(gòu)建了三個重組質(zhì)粒，分別為：pCAMBIA1300-35S-RNRM、pCAMBIA1300-35S-RNRL、pCAMBIA1300-35S-RNRM-35S-RNRL。采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法成功將3個重組質(zhì)粒的T-DNA片段分別整合到蛹蟲草菌基因組中，篩選、鑒定，獲得3組重組蛹蟲草菌株分別為：CM-M、CM-L及CM-M-L，即分別整合了RNRM、RNRL及同時整合了RNRM與RNRL基因的蛹蟲草菌。利用熒光定量PCR及WesternBlot法對目的基因進行
7、mRNA和蛋白表達水平的檢測，結(jié)果顯示目的基因均在轉(zhuǎn)化菌株里成功表達。I成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2018屆碩士研究生學(xué)位論文利用HPLC法檢測3組重組菌株及對照組的蟲草素含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CM-M較對照組，蟲草素含量明顯升高，在第10天時，其表達量為對照組的1.8倍，CM-L較對照組無明顯變化，CM-M-L較對照組蟲草素含量低，推測RNRM基因可能對蟲草素合成發(fā)揮重要作用，而RNRM與RNRL同時存在時形成RNR全酶，更傾向于還原腺苷，形成2'-脫氧腺苷，與蟲草素合成途徑形成競爭。因此，本研究認為腺苷為蟲草素和
8、2'-脫氧腺苷的共同前體物質(zhì)，RNR小亞基在蟲草素合成途徑中起著重要作用，蟲草素合成途徑可能與腺苷代謝途徑存在競爭關(guān)系，但RNRM在蟲草素合成過程中的作用機制有待進一步深入探究。關(guān)鍵詞：冬蟲夏草；蛹蟲草；核糖核苷酸還原酶RNR；遺傳轉(zhuǎn)化；蟲草素生物合成II成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院2018屆碩士研究生學(xué)位論文ABSTRACTCordycepsisacomplexofcordycepsfungus,whichisparasiticon
