新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)及鑒定

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1、學(xué)術(shù)學(xué)位碩±學(xué)位論文單位代碼：１０６７８分類號(hào)；Ｒ３２２．別學(xué)號(hào)：２０１２２巧密級(jí)；尾略Ｍ牛Ａ常碩±學(xué)位論文戀新生大鼠小膠扇細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)及鑒定院候一）、所昆明醫(yī)科大學(xué)第臨床醫(yī)學(xué)院研究生姓名余蘇華學(xué)科、專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）學(xué)位類型學(xué)術(shù)學(xué)位指導(dǎo)教師李玉副教授二〇—五年五月見咚ｉｌ鐘常碩±學(xué)位論文新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)及鑒定研究生姓名余蘇華學(xué)科、專業(yè)外科學(xué)（神經(jīng)外科）申請(qǐng)學(xué)位類型學(xué)術(shù)學(xué)位指導(dǎo)教師李玉副教授指導(dǎo)小組教師鄧興力副教授完成日期二〇—五年五月

2、兔略ｉｌ鐘Ａ掌研究生學(xué)位論文研巧撰寫聲明本人鄭重聲明；本學(xué)位論文是我本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行學(xué)位課題研究所取得的研巧成果。論文中除特別加標(biāo)注和致謝的地方外，不包含他人或其他機(jī)構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果。對(duì)本研巧和論文做過(guò)貢獻(xiàn)的同道我均在論文中作了明確的說(shuō)明并表明謝意。該學(xué)位論文資料若有不實(shí)之處，本人愿承擔(dān)一切相關(guān)責(zé)任。論文作者（簽名年月；Ｉ曰見疇Ｓ種Ａ常研究生學(xué)位論文版權(quán)使用授極書本學(xué)位論文作者完全了解屋明醫(yī)科大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部口或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被査閱和借

3、閱，。學(xué)校可公布論文的全部或部分內(nèi)容（確屬保密內(nèi)容已注明并在解密后遵守此規(guī)定。）；學(xué)?？刹捎糜坝?、縮印或其他手段保存本學(xué)位論文學(xué)位論文作者（簽名）：指導(dǎo)教師（簽名和－年－ｙ月２Ｌ曰戶｜＼年］月枉本人及導(dǎo)師同意將學(xué)位論文提交至清華大學(xué)＂中國(guó)學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志化巧行電子和網(wǎng)絡(luò)出脫并編入ＣＮＫＩ系列數(shù)據(jù)庫(kù)，傳播本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，同意按《中國(guó)優(yōu)秀博碩±學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)出版章程》規(guī)定享受相關(guān)權(quán)益。、‘學(xué)位論文作者（簽名）；指導(dǎo)教師（簽名）：和＇？年ｆ月曰年月義巧基金巧目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助（編號(hào)：８１２４１１２６、

4、８１３６０１９７）目錄中文摘要１Ａｂｓｔｒａｃｔ３符號(hào)說(shuō)明６引胃８材料與方法１３１．材料１３１．１主要儀器設(shè)備１３１．２實(shí)驗(yàn)試劑及材料１４１．３實(shí)驗(yàn)動(dòng)物１４１．４主要溶液配制１４２．１５巧法２１１．海合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察５２．２小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化１７２３１９．細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)粉藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)２１．４小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定９２．５小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型的建立２０２．６統(tǒng)計(jì)學(xué)處理２１結(jié)果２２１泡合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)２２２小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化２４３細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞拒染實(shí)

5、驗(yàn)２７４免疫英光染色鑒定２９５小膠質(zhì)細(xì)胞活化模型分析３１ＭＶｔ３５結(jié)論４２參考文獻(xiàn)４３：＾：獻(xiàn)綜述４８論文發(fā)表情況５７ａｍ５８屋明醫(yī)科大學(xué)碩±研巧生學(xué)位論文新生大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化、培養(yǎng)及鑒定碩±研究生：余蘇華導(dǎo)師：李玉副教授昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科中文摘要目的：探討原代小膠質(zhì)細(xì)胞純化分離培養(yǎng)的方法一，從而建立種簡(jiǎn)易的、高產(chǎn)量的、高純度的連續(xù)獲得小膠扇細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型，同時(shí)建立小膠質(zhì)細(xì)胞活化的模型，為小膠質(zhì)細(xì)胞移植治療帕金森病的相關(guān)實(shí)驗(yàn)提供足夠細(xì)胞材料。方法：￣

6、１．混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)：取新生ｌ２ｄＳＤ大鼠，酒精浸泡消毒，斷頭處死，冷Ｄ－Ｈａｎｋｓ反復(fù)沖洗，顯微鏡下取兩側(cè)大腦半球，剔除腦膜、血管，剪碎腦組織，加入族蛋白酶消化，再加入ＤＭＥＭ／Ｆ１２終止消化，巧濾，離也，棄上清液，ｓ重新制成細(xì)胞懇液，細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至〇ｘｌ〇／ｍｌｌ接種于３個(gè)預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中一，隨機(jī)分成Ａ、Ｂ、ＣＨ姐，，同恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)２４ｈ后完全換液，３ｄ換液Ｉ次，半量換液。２￣．小膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化；待混合培養(yǎng)第７９ｄ，將隨機(jī)分成的Ｈ組細(xì)胞分離純化，Ａ組：恒溫振蕩法；Ｂ組：溫和膜酶消化法；Ｃ組：利多卡因分離法。加入培養(yǎng)基

7、重新吹打成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)拒染試驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞存活率，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)５ｘ數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度至ＩｌＯ／ｍｌ接種于預(yù)先放有蓋玻片（多聚賴氨酸包被）的相應(yīng)Ａ一、Ｂ、ＣＨ個(gè)６孔３０培養(yǎng)板中，ｍｉｎ后完全換液次，去除未貼壁細(xì)胞，再加入新培養(yǎng)液入同一２４ｈ３ｄ，放恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。后完全換液，換液１次。３．小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定；待分離純化繼續(xù)培養(yǎng)９ｄ后，再利用ＣＤＨｂ（０Ｘ４２）免疫英光染色對(duì)分離純化的小膠質(zhì)細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。４．脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞：收集原代小