大鼠少突膠質(zhì)細胞的純化培養(yǎng)與鑒定

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1、大鼠少突膠質(zhì)細胞的純化培養(yǎng)與鑒定【摘要】目的探討新生2dSpragueDaratcerebraltissue.MethodsBasedonthedifferentpropertiesofdevelopmentaltimecourses，cellularadhesionsandgroediumandidentifiedbyimmmunofluorescentstaining.ResultsTheripeoligodendrocytesethoda），PDGFAA、bFGF（Peprotech），胰島素、甲狀腺素均為醫(yī)用試劑。DMEM/

2、F12(1∶1)條件培養(yǎng)基A配方為DMEM/F12（1∶1）、10ng/mLPDGF、10ng/mLbFGF、0.5%FCS。DMEM/F12(1∶1)條件培養(yǎng)基B配方［5］為DMEM/F12（1∶1）、亞硒酸鈉0.8μg/mL、腐胺16.1mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L、胰島素5mg/L、甲狀腺素0.4μg/L、碳酸氫鈉2.2g/L。②免疫熒光的主要試劑。小鼠抗大鼠A2B5單克隆抗體(R＆D)、兔抗大鼠Gal多克隆抗體（Chemicon）、山羊抗小鼠IgM抗體TRITC（SouthernBiotech）、山羊抗兔IgGFITC（中杉

3、公司）。1.2方法1.2.1大鼠皮層膠質(zhì)細胞混合培養(yǎng)取出生48h之內(nèi)的SD大鼠，無菌條件下取大腦，置入PBS液中，在解剖顯微鏡下剔除腦膜及血管，分離出大腦皮層。剪碎后，反復(fù)機械輕輕吹打，100目濾器過濾，1500r/min離心5min，棄上清。加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS，使細胞充分分離，然后以1×106的密度接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3d換液一次。1.2.2O2A純化及少突膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)細胞生長7～8d后可分為兩層，用封口膜封閉培養(yǎng)瓶口，置于37℃恒溫搖床中，150r/min振蕩

4、2h后，吸掉上層培養(yǎng)液，去除小膠質(zhì)細胞，加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS，再以250r/min振蕩17～19h，收集脫落細胞于離心管內(nèi)，1500r/min離心10min，棄上清，加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS重懸細胞，以3×104／L的密度接種于24孔培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后吸棄原培養(yǎng)基，改用DMEM/F12條件培養(yǎng)基A繼續(xù)培養(yǎng)，即可得到純化的O2A細胞。培養(yǎng)3d后改用DMEM/F12條件培養(yǎng)基B誘導(dǎo)分化，可得到成熟的少突膠質(zhì)細胞。1.3細胞生物學(xué)特性分析1.3.1細胞形態(tài)觀察倒置熒光相差顯微鏡（Ni

5、kon，TE2000s）觀察培養(yǎng)細胞的生長過程和形態(tài)學(xué)變化。1.3.2細胞免疫熒光鑒定收集含有細胞的玻片，0.01mol/LPBS（pH7.4）洗滌細胞，4%多聚甲醛固定20min，按常規(guī)方法進行細胞免疫熒光染色。一抗分別為小鼠抗大鼠A2B5單克隆抗體（5μg/mL）、兔抗大鼠Gal多克隆抗體（1∶50），二抗分別為山羊抗小鼠IgM抗體TRITC（1μg/106cells）、山羊抗兔IgGFITC（1∶200）?？瞻讓φ站肞BS代替一抗。2結(jié)果2.1細胞形態(tài)觀察2.1.1混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)①混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)第3天，倒置熒光相差顯微鏡

6、下觀察，多數(shù)的細胞體積較大，胞體扁平，具有較粗的突起，呈片狀，胞核較大，圓形。在位于扁平細胞表面可見一些體積較小，胞體較透亮呈圓形或橢圓形的細胞，具有單極或雙極的細小突起。②培養(yǎng)第7～8天，倒置顯微鏡下觀察，胞體扁平，突起粗大的細胞已長滿瓶底。在表面有成堆或呈葡萄串樣生長的胞體較小、折光性強的細胞（圖1）。圖1混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)第7天(×200)2.1.2純化O2A形態(tài)觀察24h后細胞成堆聚集形成克隆球，邊緣遷移出細胞（圖2），克隆球A2B5標(biāo)記陽性（圖3）。第2～3天細胞增殖旺盛。細胞體積較小，胞體較透亮，呈圓形或橢圓形，多數(shù)細胞具有雙極

7、突起，其突起較細直無分支（圖4），A2B5標(biāo)記陽性（圖5）。2.1.3誘導(dǎo)分化后細胞形態(tài)觀察多數(shù)細胞的體積無明顯變化，部分細胞胞體增大，細胞突起明顯增多，在粗短的初級胞突上出現(xiàn)茂密的次級胞突，且相互交聯(lián)成蜘蛛網(wǎng)狀（圖6），細胞GC標(biāo)記陽性（圖7）。2.2免疫熒光鑒定O2A祖細胞A2B5熒光標(biāo)記呈陽性，紅色陽性反應(yīng)物位于胞體和突起。少突膠質(zhì)細胞Gal熒光標(biāo)記呈陽性，綠色陽性反應(yīng)物位于胞體和突起。空白對照組結(jié)果為陰性。3討論本實驗結(jié)果觀察到混合膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)7d后，貼壁的星形膠質(zhì)細胞相互融合形成一層細胞氈，O2A祖細胞則散布其上，因細胞生長

8、緩慢而無法融合。這些表現(xiàn)是因星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的生長特性不同決定的，也為振蕩分離O2A祖細胞提供了可能。振蕩頻率是影響細胞分離的重要因素，國內(nèi)報道多為80～120r/min，8～12h