大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定論文

《大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定論文【摘要】目的探討新生2dSpragueDaratcerebraltissue.MethodsBasedonthedifferentpropertiesofdevelopmentaltimecourses，cellularadhesionsandgroediumandidentifiedbyimmmunofluorescentstaining.ResultsTheripeoligodendrocytesethoda），PDGFAA、bFGF（Peprotech），胰島

2、素、甲狀腺素均為醫(yī)用試劑。DMEM/F12(1∶1)條件培養(yǎng)基A配方為DMEM/F12（1∶1）、10ng/mLPDGF、10ng/mLbFGF、0.5%FCS。DMEM/F12(1∶1)條件培養(yǎng)基B配方［5］為DMEM/F12（1∶1）、亞硒酸鈉0.8μg/mL、腐胺16.1mg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白50mg/L、胰島素5mg/L、甲狀腺素0.4μg/L、碳酸氫鈉2.2g/L。②免疫熒光的主要試劑。小鼠抗大鼠A2B5單克隆抗體(R＆D)、兔抗大鼠Gal多克隆抗體（Chemicon）、山羊抗小鼠IgM抗體TRIT

3、C（SouthernBiotech）、山羊抗兔IgGFITC（中杉公司）。1.2方法1.2.1大鼠皮層膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)取出生48h之內(nèi)的SD大鼠，無(wú)菌條件下取大腦，置入PBS液中，在解剖顯微鏡下剔除腦膜及血管，分離出大腦皮層。剪碎后，反復(fù)機(jī)械輕輕吹打，100目濾器過(guò)濾，1500r/min離心5min，棄上清。加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS，使細(xì)胞充分分離，然后以1×106的密度接種于預(yù)先涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，3d換液一次。1.2.2O2A純化及少突膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分

4、化培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)7～8d后可分為兩層，用封口膜封閉培養(yǎng)瓶口，置于37℃恒溫?fù)u床中，150r/min振蕩2h后，吸掉上層培養(yǎng)液，去除小膠質(zhì)細(xì)胞，加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS，再以250r/min振蕩17～19h，收集脫落細(xì)胞于離心管內(nèi)，1500r/min離心10min，棄上清，加入培養(yǎng)基高糖DMEM，含15%FCS重懸細(xì)胞，以3×104／L的密度接種于24孔培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后吸棄原培養(yǎng)基，改用DMEM/F12條件培養(yǎng)基A繼續(xù)培養(yǎng)，即可得到純化的O2A細(xì)胞。培養(yǎng)3d后改用D

5、MEM/F12條件培養(yǎng)基B誘導(dǎo)分化，可得到成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞。1.3細(xì)胞生物學(xué)特性分析1.3.1細(xì)胞形態(tài)觀察倒置熒光相差顯微鏡（Nikon，TE2000s）觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和形態(tài)學(xué)變化。1.3.2細(xì)胞免疫熒光鑒定收集含有細(xì)胞的玻片，0.01mol/LPBS（pH7.4）洗滌細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20min，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。一抗分別為小鼠抗大鼠A2B5單克隆抗體（5μg/mL）、兔抗大鼠Gal多克隆抗體（1∶50），二抗分別為山羊抗小鼠IgM抗體TRITC（1μg/106cells）

6、、山羊抗兔IgGFITC（1∶200）?？瞻讓?duì)照均用PBS代替一抗。2結(jié)果2.1細(xì)胞形態(tài)觀察2.1.1混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)①混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)第3天，倒置熒光相差顯微鏡下觀察，多數(shù)的細(xì)胞體積較大，胞體扁平，具有較粗的突起，呈片狀，胞核較大，圓形。在位于扁平細(xì)胞表面可見(jiàn)一些體積較小，胞體較透亮呈圓形或橢圓形的細(xì)胞，具有單極或雙極的細(xì)小突起。②培養(yǎng)第7～8天，倒置顯微鏡下觀察，胞體扁平，突起粗大的細(xì)胞已長(zhǎng)滿瓶底。在表面有成堆或呈葡萄串樣生長(zhǎng)的胞體較小、折光性強(qiáng)的細(xì)胞（圖1）。圖1混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)第7天(×200)2

7、.1.2純化O2A形態(tài)觀察24h后細(xì)胞成堆聚集形成克隆球，邊緣遷移出細(xì)胞（圖2），克隆球A2B5標(biāo)記陽(yáng)性（圖3）。第2～3天細(xì)胞增殖旺盛。細(xì)胞體積較小，胞體較透亮，呈圓形或橢圓形，多數(shù)細(xì)胞具有雙極突起，其突起較細(xì)直無(wú)分支（圖4），A2B5標(biāo)記陽(yáng)性（圖5）。2.1.3誘導(dǎo)分化后細(xì)胞形態(tài)觀察多數(shù)細(xì)胞的體積無(wú)明顯變化，部分細(xì)胞胞體增大，細(xì)胞突起明顯增多，在粗短的初級(jí)胞突上出現(xiàn)茂密的次級(jí)胞突，且相互交聯(lián)成蜘蛛網(wǎng)狀（圖6），細(xì)胞GC標(biāo)記陽(yáng)性（圖7）。2.2免疫熒光鑒定O2A祖細(xì)胞A2B5熒光標(biāo)記呈陽(yáng)性，紅色陽(yáng)性反應(yīng)物

8、位于胞體和突起。少突膠質(zhì)細(xì)胞Gal熒光標(biāo)記呈陽(yáng)性，綠色陽(yáng)性反應(yīng)物位于胞體和突起。空白對(duì)照組結(jié)果為陰性。3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察到混合膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)7d后，貼壁的星形膠質(zhì)細(xì)胞相互融合形成一層細(xì)胞氈，O2A祖細(xì)胞則散布其上，因細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢而無(wú)法融合。這些表現(xiàn)是因星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性不同決定的，也為振蕩分離O2A祖細(xì)胞提供了可能。振蕩頻率是影響細(xì)胞分離的重要因素，國(guó)內(nèi)報(bào)道多為80～120r/min，8～1