柞蠶防御基因defense的克隆、表達(dá)與功能分析

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1、３６４分類號；單位代碼；１０密級：學(xué)號：口７２０４：３８安推卷乂ｆ學(xué)位論文昨蠶防御基因柳ｉｗｓｃ的克隆、表達(dá)與功能分析ＣｌｏｎｉｎｇＥｘｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＡｎａｌｓｉｓｏｆａＮｏｖｅｌｄｅｆｅｎｓｅＧｅｎｅｆｒｏｍ，ｐｙＡｎｔｈｅｒａｅａｅｒｎｉｐｙ研究生：張小娟指導(dǎo)教師：劉朝良教授合作指導(dǎo)教師；失傑建副教授申請學(xué)位口類級別：理學(xué)碩±專業(yè)名稱；生物化學(xué)與分子生物學(xué)研巧方向：昆蟲生物化學(xué)與分子生物學(xué)所在學(xué)院；生命科學(xué)學(xué)

2、院答辯委員會主席：或起豕二零一五年六月獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加標(biāo)注和致謝的地方夕ｈ論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：％簽字＊曰期：方３）５年ｔ月曰學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)

3、定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部口或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文件，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，可采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文，向社會公眾提供信息服務(wù)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）。糸學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名；復(fù)韻■＾簽字日期：＞皆年６月日簽字日期：年！月曰＇ｙ工學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：通作單位：電話；；信地址；郵編；摘要免疫反應(yīng)分為兩個分支，先天

4、性免疫和獲得性免疫,昆蟲不具備哺乳動物那樣完善的獲得性免疫系統(tǒng),因此先天免疫就成為了其抵抗病原微生物入侵的主要手段，而昆蟲的先天免疫又分為細(xì)胞免疫和體液免疫兩大部分，二者共同作用抵御病原物的侵染。細(xì)胞免疫包括吞噬、集結(jié)和包囊等作用類型，同時體液免疫主要包括黑色素形成和抗菌肽產(chǎn)生兩種機制。柞蠶是一種重要的野生絹絲昆蟲，主要分布區(qū)域分別在亞洲國家，具有可以作為紡織工業(yè)原料利用的價值，而且具備很高的藥用和食用經(jīng)濟價值，因此，對柞蠶先天免疫防御相關(guān)基因的研究對于提高柞蠶抗病能力具有重要的理論意義，此外，也可以推進鱗翅目其他昆蟲相關(guān)研究，從而進一

5、步為鱗翅目病蟲害的防治提供借鑒。利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對柞蠶defense基因進行分析研究，得到的主要研究成果有以下幾點：1．ApDef基因的克隆及序列分析：通過實驗克隆出ApDef基因的cDNA序列，總長677bp，包括編碼163個氨基酸的開放閱讀框（ORF），以及5’端非編碼區(qū)(5’UTR)和3’端非編碼區(qū)(3’UTR)分別為63bp和122bp。預(yù)測蛋白分子量約為17kDa，理論等電點為4.74；該蛋白屬于親水性蛋白，有明顯的信號肽，沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，且亞細(xì)胞定位在線粒體或其它部位的可能性很小，位于胞外的可能性最大。構(gòu)

6、建的系統(tǒng)進化樹顯示柞蠶與天蠶親緣關(guān)系最近，與哺乳動物人和小鼠的距離較遠(yuǎn)。2.ApDef基因的表達(dá)分析：提取柞蠶五齡時期不同組織總RNA，設(shè)計特異性引物，進行了實時熒光定量PCR（QRT-PCR）。實驗結(jié)果顯示，選取的組織表達(dá)量有明顯差異，在脂肪體中表達(dá)量最高，血細(xì)胞和中腸中有微量表達(dá)，表皮中不表達(dá)。PCR擴增柞蠶ApDef基因的ORF，連接到pET-28a(+)表達(dá)載體，并且轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，用IPTG進行了不同濃度的誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE電泳和Westernblot方法檢測驗證，表明被誘導(dǎo)的目的蛋白均得到了穩(wěn)

7、定的表達(dá)。用IPTG進行了重組蛋白大量誘導(dǎo)并純化，制備單克隆抗體。用大腸桿菌，藤黃微球菌和白僵菌處理五齡期柞蠶，提取其不同時間段不同處理方式的柞蠶脂肪體RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，設(shè)計特異性引物，進行了實時熒光定量PCR（QRT-PCR）。實驗結(jié)果顯示，ApDef的表達(dá)水平與對照相比顯著上調(diào)，而且在感染12小時后達(dá)到最大。這些數(shù)據(jù)表明，ApDef可能在柞蠶的先天免疫應(yīng)答中起重要作用。關(guān)鍵詞：柞蠶，先天免疫，防御基因，Reeler結(jié)構(gòu)域，實時熒光定量PCR。IAbstractImmunereactionisgenerallydividedin

8、totwobranches,innateimmunityandacquiredimmunity.Insectsdonothaveperfectacquiredimmunesystemlikemammal,t