克隆柞蠶免疫相關(guān)基因克隆和誘導(dǎo)表達(dá)

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1、克隆柞蠶免疫相關(guān)基因克隆和誘導(dǎo)表達(dá)　　昆蟲免疫主要是以產(chǎn)生的抗菌肽、抗病毒因子、凝集素、溶菌酶及蛋白酶抑制劑等多種活性物質(zhì),配合多種功能的血細(xì)胞建立的一個(gè)開放防御體系.昆蟲僅具有先天性免疫,不具有適應(yīng)性免疫.昆蟲的先天免疫系統(tǒng)主要分為細(xì)胞免疫和體液免疫2大部分.體液免疫中轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-κB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有Toll通路和Imd通路[1],昆蟲主要通過這2種通路抵抗微生物的侵染.　　研究發(fā)現(xiàn),這2種通路通過激活不同的Rel/NF-κB家族成員調(diào)控不同抗菌肽基因的表達(dá),其中Toll通路主要

2、激活轉(zhuǎn)錄因子Dorsal和Dif,Imd通路主要激活轉(zhuǎn)錄因子Relish[1-5].已知的Rel/NF-κB蛋白家族成員有8種,哺乳動(dòng)物中有5種,昆蟲細(xì)胞中的3種分別是Dorsal、Dif和Relish.其中Dorsal和Dif無錨定重復(fù)序列,Relish有錨定重復(fù)序列.Rel/NF-κB蛋白的主要功能是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)發(fā)育,炎癥、癌癥、自身免疫疾病等病理過程與NF-κB的過度活化相關(guān)[6].　　由于Rel/NF-κB介導(dǎo)的Toll通路與Imd通路在

3、無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中非常保守[1,7],因此,對(duì)昆蟲Rel/NF-κB的研究不僅能夠系統(tǒng)了解昆蟲的先天免疫機(jī)制,而且可為深入了解高等動(dòng)物的免疫機(jī)制及疾病防治提供重要依據(jù).盡管Rel/NF-κB蛋白在先天免疫過程中起著非常重要的作用,但目前為止尚未見到有關(guān)柞蠶Rel/NF-κB家族成員的報(bào)道.本項(xiàng)研究利用生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù),以柞蠶蛹為試驗(yàn)材料,克隆柞蠶免疫相關(guān)基因Apdorsal的全長(zhǎng)cDNA序列,并將其編碼的氨基酸序列與其它物種的Rel/NF-κB氨基酸序列進(jìn)行

4、比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Apdorsal基因經(jīng)不同微生物誘導(dǎo)處理后的組織表達(dá)變化,為探討柞蠶的先天免疫機(jī)制提供參考.　　1材料與方法1.1材料和主要試劑供試柞蠶品種為青6號(hào),柞蠶蛹由遼寧省蠶業(yè)科學(xué)研究所惠贈(zèng),4℃條件下保存?zhèn)溆?大腸桿菌(E.coli)Top10、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、畢赤酵母(Pichiapastoris)、柞蠶核型多角體病毒(ApNPV)等微生物由本實(shí)驗(yàn)室保存.Trizol試劑,ReverseTranscriptaseM-MLV試劑盒,ExTaq酶

5、,凝膠回收試劑盒,pMD18-T載體,T4-DNA連接酶,限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ,RLM-RACE試劑盒,SYBR-PrimeScript-RT-PCRKit(PerfectRealTime),均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司.　　1.2柞蠶蛹總RNA提取及目的基因的RT-PCR擴(kuò)增取20μL培養(yǎng)過夜的E.coliTop10,注射到柞蠶蛹體內(nèi),12h后解剖取脂肪體組織,用Trizol試劑提取柞蠶蛹脂肪體總RNA,然后按照ReverseTran-scriptaseM-MLV試劑盒說明書將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄

6、成cDNA.　　根據(jù)GeneBank登錄的煙草天蛾Dorsal(登錄號(hào):ADK39025)、家蠶Rel(登錄號(hào):NP_001036896)和岡比亞按蚊Rel(登錄號(hào):XP_310177)的cDNA序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物F(5′-TGCGARGGMCGSTCGG-3′)、R[(5′-CATKGCCTTCTTRTCG(T/A)AGATG-3′)].簡(jiǎn)并引物F/R進(jìn)行cDNA片段擴(kuò)增,反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5min;94℃變性3s,55℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72

7、℃終延伸7min.PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后純化回收,連接到pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞,通過酶切鑒定篩選陽性克隆,送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析.　　1.3目的基因的RLM-RACE擴(kuò)增根據(jù)1.2中擴(kuò)增得到的cDNA序列設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增特異引物:Dor-5′RACEouterprimer(5′-CCAGGTTGTGCGAGTGAGGC-3′),Dor-5′RACEinnerprimer(5′-ATTGTAGGGTAGGTGCG

8、GTTCTCG-3′),Dor-3′RACEouterprimer(5′-CTCGGCATCCAGTGCGTCAA-3′),Dor-3′RACEinnerprimer(5′-GGAATCACCCGC-AGAGCATC-3&prime