豬帶絳蟲烯醇化酶基因的克隆、原核表達(dá)及功能研究

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1、萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)或其他教育單位的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：一一圮易昏時(shí)間：少t爭(zhēng)年礦／3日關(guān)于學(xué)位論文使用授權(quán)的說明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位

2、論文，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以公布(包括刊登)論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：／多夠角時(shí)間：≯．壚年多月B日鈉獬：為vv八．帥：印中年多刖如萬方數(shù)據(jù)本文是家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主課題資助項(xiàng)目“豬帶絳蟲基因組和轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序研究”的部分研究成果(項(xiàng)目編號(hào)：SKIⅦB2011ZZKT007)課題主持人：才學(xué)鵬研究員(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所)萬方數(shù)據(jù)豬帶絳蟲烯醇化酶基因的克隆、原核表達(dá)及功能研究摘要豬囊尾蚴是帶科帶屬的豬帶絳蟲(Taeniasoliu

3、m)幼蟲，常見于肌肉組織，引起豬和人的囊蟲病，進(jìn)而影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類的健康。由于寄生環(huán)境的影響，豬帶絳蟲以糖酵解為主，進(jìn)行物質(zhì)和能量代謝。烯醇化酶(enolase，ENO，酶分類編號(hào)：EC4．2．1．11)是一種多功能蛋白，廣泛存在于許多生物體內(nèi)，不僅作為糖酵解酶影響細(xì)胞的物質(zhì)和能量代謝，又具有參與病原體入侵宿主、免疫刺激蛋白及熱激蛋白等多種功能。因此，本文對(duì)enolase進(jìn)行了克隆、表達(dá)及功能的研究。取得如下結(jié)果：1．以豬帶絳蟲的cDNA為模板，首次擴(kuò)增獲得豬帶絳蟲enolase基因。Real-timePCR結(jié)果表明，enolase在成蟲期表達(dá)量高。利用生物信息學(xué)

4、軟件，對(duì)該基因進(jìn)行序列分析。序列分析表明該基因ORF大小為1302bp，編碼433個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量為46．56l(1l，分析了豬帶絳蟲烯醇化酶可能的纖溶酶原結(jié)合基序(238GKVKIGMDVAASEFYQDGKYNLDF261)。2．成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-ENO，并獲得了以可溶性形式高效表達(dá)的重組蛋白rTsENO，大小約為53ku。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果表明，rTSENO能被豬囊尾蚴病陽性血清特異性識(shí)別。配基試驗(yàn)、纖溶酶原激活試驗(yàn)及競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)結(jié)果表明：rTsENO具有良好的纖溶酶原結(jié)合能力；當(dāng)存在纖溶酶原激活劑t-PA時(shí)，rT

5、sENO促進(jìn)纖溶酶原被激活并產(chǎn)生纖溶酶；6-ACA可以抑制rTsENO與纖溶酶原的結(jié)合。3．應(yīng)用rTsENO免疫家兔，經(jīng)4次免疫后，家兔產(chǎn)生了高滴度的特異性IgG抗體。免疫組化試驗(yàn)結(jié)果表明，rTsENO主要在成蟲的體壁及生殖器官內(nèi)表達(dá)。4．在不同底物濃度、不同rTsENO濃度、不同pH值及不同金屬離子存在條件下，利用紫外分光光度計(jì)，連續(xù)檢測(cè)rTsENO在240nm時(shí)磷酸烯醇式丙酮酸吸光度的增加量或減少量。結(jié)果表明：以2-PGA為底物所測(cè)的rTsENO比活力為60．724-0．84U(mgprotein)～，以PEP為底物所測(cè)的rTsENO比活力為22．644-1．05U

6、(mgprotein)-1。rTSENo的最佳pH值范圍是7~7．5。在金屬離子存在時(shí)，rTsENO才具有酶活力，_且M92+存在時(shí)，rTSENo酶活力最高。NaCI、MgCl2和CaCl2均具有抑制rTsENO酶活力的作用。在以2-PGA為底物時(shí)，50,--200mmol／LKCI對(duì)rTsENO酶活力有輕微激活作用；以PEP為底物時(shí)，在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，KCI均呈現(xiàn)抑制作用。綜上所述，重組表達(dá)的豬帶絳蟲烯醇化酶(rTsENO)能被豬囊尾蚴病陽性血清特異性識(shí)別，具有良好的纖溶酶原結(jié)合能力及酶活力。這為進(jìn)一步闡明豬帶絳蟲的代謝、入侵及致病機(jī)理奠定了理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：豬帶絳蟲

7、；烯醇化酶；表達(dá)；免疫定位；纖溶酶原；酶活力萬方數(shù)據(jù)GeneCloning，ProkaryoticExpressionandCharacterizationofEnolasefromTaen缸soliumAbstractThelarvalstageoftheTaeniidaeTaenh7soliummainlyinfectsmuscletissues．whichcancausecysticercosisinpigsandhumans．therebyaffectingtheproductionofpigsandthehealthofhuma