重組zen降解酶a4-prx的純化、酶學特性和降解產(chǎn)物初步研究

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1、碩士學位論文重組ZEN降解酶A4-Prx的純化、酶學特性和降解產(chǎn)物初步研究作者姓名鐘鳳學科專業(yè)食品質量與安全指導教師吳暉教授所在學院輕工與食品學院論文提交日期2015年6月Thepurification,enzymaticcharacteristics,anddegradationproductsofRecombinantZEN-degradingenzymeA4-PrxADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhongFengSupervisor：Prof.WuHuiSouthChinaUniversityof

2、TechnologyGuangzhou,China分類號：TS201.3學校代號：10561學號：201220122170華南理工大學碩士學位論文重組ZEN降解酶A4‐Prx的純化、酶學特性和降解產(chǎn)物初步研究國家自然科學基金資助項目(31201330);廣東省科技攻關項目(20130000202）資助作者姓名：鐘鳳指導教師姓名、職稱：吳暉教授申請學位級別：工學碩士學科專業(yè)名稱：食品質量與安全研究方向：食品微生物論文提交日期：2015年6月11日論文答辯日期：2015年6月9日學位授予單位：華南理工大學學位授予日期：年月日答辯委員會成員：主席：委員：華南理工大學學位論文原創(chuàng)性聲

3、明明：所呈交的論文是本人在導_指導下獨立賄研究所果。除’文中特別加以標注引勵內容外，本論文不包含任已經(jīng)發(fā)表或撰寫_果作品。對本文_究做出重要貢法律綱。本人完全_本聲明的作者簽名：眾賺攤叫日學位論文版權使用授權書孤六全了解學校有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即??研九生在校攻位期丨Hj論文工作的知識產(chǎn)權單位屬華南理r大學。有權保存并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版，允^論文被查丨3(除在保密期內的保密論文外）；學?？梢怨紝W位論文的部或部分內容，可以允許采娜印、縮印或其它復制手段保存、匯編論文。本人電子文檔的內容和紙質論文的內容相一致。本學位論文屬于：密，在____年

4、解密后適用本授權書。保密，同意在校園網(wǎng)上發(fā)布，供校內師生和與學校有共享協(xié)的單位瀏覽；同意將本人學位論文提交中國學術期刊(光盤版)電:^雜東出版和編入CNKI《中國知識資源總庫》，傳播學位論文的全部分(請在以上相應方框內打“V”）作者簽名.?曰期:⑷1指導教師簽名：日期2以‘0作者聯(lián)系電話：電子郵箱：聯(lián)系地址(含郵編):摘要玉米赤霉烯酮（Zearalenone,ZEN,ZEA）是一種具有二羥基苯甲酸內酯結構的真菌毒素，由鐮刀屬(Fusarium)真菌產(chǎn)生，主要存在于霉變的玉米、小麥等谷類作物中，具有生殖毒性、內分泌毒性和肝臟毒性，對家禽家畜危害明顯，并威脅著人類的健康。相比物理

5、和化學去除ZEN毒素的方法，生物法脫毒效率高、特異性強，對食物的營養(yǎng)成分破壞少，反應產(chǎn)物無毒，對環(huán)境無污染，是目前生物毒素研究的熱點。本實驗室從土壤中分離出一株不動桿菌Acinetobactersp.SM04可將ZEN降解成極低雌激素毒性的產(chǎn)物，從其培養(yǎng)上清液中分離出一種過氧化物酶組分，并將其基因克隆表達到畢赤酵母宿主內，優(yōu)化培養(yǎng)后可大量分泌表達該重組過氧化物酶A4-Prx。本論文致力于從該重組畢赤酵母的培養(yǎng)上清液中分離純化得到過氧化物酶A4-Prx，研究其酶學特性，初步探索ZEN毒素被A4-Prx降解后的結構變化。本論文通過誘導培養(yǎng)重組畢赤酵母工程菌GS115/pPIC9K

6、-A4-Prx，從其培養(yǎng)上清液中采用一系列蛋白分離純化手段得到重組過氧化物酶A4-Prx，研究結果表明先用60%硫酸銨沉淀，再用0.02MTris-HCl（pH8.0）進行凝膠過濾SephadexG-100柱洗脫，然后進行離子交換SephadexDEAE-52柱的梯度鹽洗脫，三個步驟結合得到高純度且具有生物活性的過氧化物酶A4-Prx，分子量為41kDa。監(jiān)測純化過程中的過氧化物酶酶活變化，得出最終純化倍數(shù)為12倍，純化效果良好。本論文對過氧化物酶A4-Prx進行了酶學特性研究，結果顯示：反映體系中的pH和反應溫度均對過氧化物酶A4-Prx的酶活有著顯著影響，pH為9.0和溫

7、度為60℃時A4-Prx的過氧化物酶酶活最高；當H2O2濃度低于20mmol/L時，A4-Prx的過氧化物酶酶活隨著H2O2濃度的升高而升高，反應符合米氏方程一級反應動力學，但當H2O2濃度高于50mmol/L時，A4-Prx的過氧化物酶酶活開始下降，最大酶活反應速率Vmax等于204.1U，此時Km值為4.85mmol/L；苯酚和4-氨基安替吡啉兩種底物的濃度升高時，過氧化氫的Km值降低，但Vmax基本不變；兩種抑制劑中，EDTA對過氧化物酶A4-Prx的酶活抑制作用顯著，EDTA濃度為10mmol/