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1、碩士學(xué)位論文Na+-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽的表達(dá)純化與行為表征的研究THEEXPRESSIONPURIFICATIONANDBEHAVIORALCHARACTERIZATIONOFNTCP熊智哈爾濱工業(yè)大學(xué)2018年6月國內(nèi)圖書分類號(hào)：Q71學(xué)校代碼：10213國際圖書分類號(hào)：577.21密級(jí)：公開碩士學(xué)位論文Na+-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽的表達(dá)純化與行為表征的研究碩士研究生：熊智導(dǎo)師：黃志偉教授申請(qǐng)學(xué)位：理學(xué)碩士學(xué)科：生物學(xué)所在單位：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院答辯日期：2018年6月授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)ClassifiedIndex:Q71U.D.C:577.21Dissertatio
2、nfortheMasterDegreeTHEEXPRESSIONPURIFICATIONANDBEHAVIORALCHARACTERIZATIONOFNTCPCandidate：XiongZhiSupervisor：Prof.HuangZhiweiAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefence：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstitut
3、eofTechnology哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文摘要鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽（sodiumtaurocholatecotransportingpolypeptide,NTCP）是第10個(gè)溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（solutecarrierSLC10）家族的一名成員。NTCP蛋白特異性地在肝細(xì)胞的基底膜上表達(dá)，其負(fù)責(zé)調(diào)控肝腸的膽汁酸循環(huán)，以維持機(jī)體的膽汁酸平衡。最新研究發(fā)現(xiàn)，NTCP蛋白是乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）和丁型肝炎病毒（HepatitisDvirus,HDV）感染肝細(xì)胞的功能性受體。所以獲得NTCP的結(jié)構(gòu)，對(duì)乙肝的治療及對(duì)NTCP的功能的進(jìn)一步闡
4、述具有重大意義。本課題以人類、小鼠、大鼠、樹鼩、食蟹猴的NTCP蛋白為研究對(duì)象，根據(jù)這5個(gè)物種的NTCP片段設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物，克隆出這5種NTCP基因片段，并分別構(gòu)建重組表達(dá)載體，以昆蟲細(xì)胞為表達(dá)宿主，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得目的蛋白。通過Ni柱親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行富集粗提；然后利用AKTAFPLC純化系統(tǒng)，通過Superdex200觀察目的蛋白與不同去垢劑的結(jié)合情況，找出合適的去垢劑用于蛋白的純化，為后續(xù)的結(jié)晶做準(zhǔn)備。本課題通過PCR反應(yīng)獲得了人類、小鼠、大鼠、樹鼩、食蟹猴的NTCP基因片段，并將這些NTCP基因片段分別與帶有不同標(biāo)簽的pFastBac構(gòu)建了
5、重組載體。利用這些重組載體轉(zhuǎn)化DH10感受態(tài)細(xì)胞，再通過藍(lán)白斑篩選得到了帶有不同標(biāo)簽的NTCP重組黏粒。用轉(zhuǎn)染試劑將這些NTCP重組黏粒轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞獲得重組桿狀病毒用于感染昆蟲細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了帶不同標(biāo)簽的NTCP蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)。通過對(duì)比這些NTCP蛋白在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)帶SUMO標(biāo)簽和MBP標(biāo)簽的樹鼩的NTCP蛋白的表達(dá)量較多。觀察帶MBP標(biāo)簽的樹鼩的NTCP蛋白在Superdex200與不同去垢劑的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)樹鼩的NTCP蛋白在去垢劑C325S中有較好的行為表現(xiàn)。最后，在純化樹鼩的NTCP蛋白時(shí)，讓樹鼩的NTCP蛋白先與多肽Myr47結(jié)合后，再觀察其在去垢劑C3
6、25S中的行為表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)樹鼩的NTCP蛋白先與多肽Myr47結(jié)合后，聚合的樹鼩的NTCP蛋白減少了。本課題的研究為抗HBV新藥的研發(fā)提供一些參考價(jià)值。關(guān)鍵詞：鈉離子-?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽；乙型肝炎病毒；蛋白純化；行為表征I哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractSodium-taurocholatecotransportingpolypeptide(NTCP)isamemberofthetenthsolutecarrier(SLC10)family.TheNTCPproteinspecificallyexpressedinthebasementmembraneofliverc
7、ellsthatareresponsiblefortheregulationofbileacidenterohepaticcirculationofbileacidsinordertomaintainthebalanceofthebody.ThelateststudyfoundthattheNTCPproteinisfunctionalreceptorsforhepatocytesinfectedbyHepatitisBvirusandHepatitisDvirus.Theref
