豬流行性腹瀉病毒（pedv）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救

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1、學(xué)校代碼：10255學(xué)號：2130635碩士學(xué)位論文豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救ConstructionofPEDVvaccinetransfervectorandrescueofrecombinantvirus學(xué)科專業(yè)：生物工程作者：陳冰清指導(dǎo)教師：孟清李震答辯日期：2015年5月27日東華大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：我恪守學(xué)術(shù)道德，崇尚嚴(yán)謹(jǐn)學(xué)風(fēng)。所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已明確注明和引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品及成果的內(nèi)容。論文為本人親自撰寫，我

2、對所寫的內(nèi)容負(fù)責(zé)，并完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：陳冰清日期：2015年5月29日豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救摘要豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的急性"接觸性"高度傳染性消化道疾病，主要癥狀為嘔吐、水樣腹瀉和脫水。PED的波及范圍廣，在全球均有病例報道。近幾年，該病在中國廣泛蔓延，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，引起了中國各研究單位對其

3、病原PEDV的關(guān)注。目前，PEDV商品化疫苗保護(hù)效力在逐年降低，主要有兩個原因，一是目前商品化疫苗與流行毒株的抗原性不匹配，二是減活疫苗毒株由于體外適應(yīng)傳代培養(yǎng)而被過度弱化。因此，新型疫苗的開發(fā)具有重要意義。本研究旨在通過靶向RNA重組反向操作平臺，將2013年流行的3株細(xì)胞適應(yīng)毒株的S基因分別替換掉原疫苗株（DR13）S基因，最終裝配出3株重組疫苗毒株作為疫苗候選毒株，為后期研發(fā)的新一代減毒活疫苗奠定基礎(chǔ)。本研究分為兩個部分。第一部分：構(gòu)建豬流行性腹瀉病毒基因工程疫苗載體。選擇三株2013年流行的細(xì)胞適應(yīng)毒株KF804028,KF650372,KF650375的SI豬流行性腹

4、瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救基因作為免疫原性基因。根據(jù)Genbank中KF804028，KF650372,KF650375的S基因的序列，通過引物小片段(三條基因共94段)進(jìn)行overlapPCR，形成一級片段，將融合得到的一級片段連接pJET-Blunt載體進(jìn)行克隆并且測序。選擇測序正確的Blunt載體，用引物進(jìn)行PCR擴增，形成13段正確的一級片段。將相鄰有21bp堿基重合區(qū)域的一級片段再次進(jìn)行PCR片段融合，形成二級片段，同樣的方法，逐級放大至四級片段，合成出3段PED流行毒株S(4161bp)基因。PED流行毒株S(4161bp)基因通過同源重組

5、的方法與p-PEDV-ΔSDR13連接，并且克隆測序，從而獲得正確的重組質(zhì)粒，即豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體。三個重組質(zhì)粒分別命名為pPEDV-DR13ΔS/KF804028S、pPEDV-DR13ΔS/KF650372S、pPEDV-DR13ΔS/KF650375S。第二部分：重組病毒的拯救。將已經(jīng)構(gòu)建好的三個攜帶流行的細(xì)胞適應(yīng)毒株S基因的重組質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄成RNA，通過電轉(zhuǎn)，使流行毒株的S基因整合進(jìn)入PEDV病毒基因組，再將重組的PEDV（rPEDV）感染VERO細(xì)胞，從而獲得能夠在VERO細(xì)胞上產(chǎn)生CPE并且連續(xù)傳代的重組PEDV。三個重組病毒分別命名為PE

6、DV-DR13ΔS/KF804028S、PEDV-DR13ΔS/KF650372S、PEDV-DR13ΔS/KF650375S。關(guān)鍵字：豬流行性腹瀉病毒，疫苗載體，重組病毒，病毒拯救II豬流行性腹瀉病毒（PEDV）基因工程疫苗載體構(gòu)建及重組病毒拯救CONSTRUCTIONOFPEDVVACCINETRANSFERVECTORANDRESCUEOFRECOMBINANTVIRUSABSTRACTPorcineepidemicdiarrhea(PED)isahighlycontactingtransmitteddiseasethatischaracterizedbyacuteent

7、eritis,vomit,diarrheaanddehydration.ThecausativeagentofPEDisPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).Inrecentyears,thediseasewidelyspreadinChina,resultinginseriouseconomiclosses,attractingmuchattentionofvariousChineseacademicinstitutions.Currently,protec