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《一株豬流行性腹瀉病毒（PEDV)的鑒定及分離培養(yǎng).doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、一株豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的鑒定及分離培養(yǎng)摘要豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的一類急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀為嘔吐、腹瀉、脫水性下痢。因PED對新生仔豬的高致死率，所以每次爆發(fā)都會對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。我國是主要發(fā)病國之一，自2010年起該病的發(fā)病率明顯升高，且規(guī)模更大。由于近年來豬流行性腹瀉的頻繁爆發(fā)，使其成為世界范圍的豬傳染病。2013年美國首次報道豬流行性腹瀉案例，并且短時間內(nèi)迅速擴散蔓延。同年,QiChen等成功分離岀美國傳播的一株P(guān)EDV流行毒株
2、。本實驗室近些年來致力于PEDV減毒活疫苗的研究工作，已經(jīng)取得了一定進展，相繼得到了不同類型的重組PEDV,但尚未進行過PEDV流行毒株的分離培養(yǎng)。本實驗嘗試以Vero細胞分離出PEDV-GJL野毒株，為今后通過RNA定向重組構(gòu)建PEDV重組病毒提供各大的研發(fā)空間。PEDV的主要致病蛋白是纖突蛋白（S蛋白），且編碼纖突蛋白的S基因突變率較高，所以根據(jù)S基因的遺傳變異關(guān)系可以一定程度上反應(yīng)PEDV流行毒株的爆發(fā)時間與地區(qū)性。本研究首先進行臨床樣本中PEDV野毒株S基因全序列的擴增測序，然后借鑒QiChen
3、等的培養(yǎng)方案，在病毒維持液中添加TPB、酵母粉、5pg/ML胰酶，延長培養(yǎng)周期等，以期在Vero細胞上分離出PEDV-GJL野毒株。分離得到的毒株在Ve「o細胞上的CPE并非常見流行毒株的合胞體狀態(tài)，而是類似DR13的病變形態(tài)。進一步做對比實驗發(fā)現(xiàn)病毒的增殖不依賴外界胰酶的存在，初步懷疑是否是DR13毒株。經(jīng)RT-PCR檢測ORF3序列，發(fā)現(xiàn)分離到的是PEDV-GJL和DR13減毒疫苗株的混合毒株，并且病毒增殖傳至第四代時野毒株P(guān)EDV-GJL丟失。取第二代病毒進行兩次空斑純化實驗，分別挑取大、小不同蝕
4、斑后得到的病毒經(jīng)鑒定都是弱毒DR13疫苗株。由分離純化結(jié)果分析，豬場免疫過弱毒DR13疫苗，采集臨床糞便樣品時攜帶有疫苗毒株。樣品RT-PCR檢測時未發(fā)現(xiàn)疫苗株的存在，但隨后分離過程中在Vero細胞上大量增殖。病毒接種后維持液中添加TPB和酵母粉是為了維持營養(yǎng)，但根據(jù)本實驗結(jié)果可能這套體系對疫苗株的分離更加有利，這個假設(shè)還需要后續(xù)進一步驗證。PEDV同源病毒的構(gòu)建是基于本實驗室已建立的反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)，以攜帶熒光標(biāo)記的重組質(zhì)粒載體PEDVwt-DR13-dORF3/RLUC為模板轉(zhuǎn)錄出病毒基因組RNA
5、,通過電擊轉(zhuǎn)染方法將RNA導(dǎo)入感染重組病毒mPEDV的LR7細胞中，經(jīng)病毒的重新裝配得到能在Vero細胞內(nèi)增殖的重組PEDV病毒。關(guān)鍵詞:豬流行性腹瀉病毒(PEDV);RT-PCR;S基因；分離培養(yǎng)；同源重組IdentificationandseparationofaPorineEpidemicDiarrheaVirusstrainABSTRACTKEYWORDS:PEDV;RT-PCR;Real-timePCR;NeautralizationPorcineepidemicdiarrhea(PED)is
6、akindofhighlycontacttransmitteddiseasethatischaracterizedbyacuteenteritis,whichcausingvomit,diarrheaanddehydration.ThecausativeagentofPEDisPorcineepidemicdiarrheavirus(PEDV).Everytimeoftheoutbreakwillcauseseriouseconomiclossbecauseofthehighlethalitytonew
7、bornpiglets.Chinaisoneofthemajiordiseaseareas,andsince2010theincidenceofPEDincreasedsignificantlywithlargerscale.Inrecentyears,thefrequentoutbreakofPED,makingitapiginfectiousdiseseworldwide.PEDwasfirstreportedinUSAatMay2013andspreadingrapidlywithashortti
8、me.Inthesameyear,QichenetsuccessfullyisolatedtwostrainsofPEDVthatpropagatinginUS.OurlaboratorycommittedtotheresearchofattenuatedlivevaccineofPEDVinrecentyears,andhasmadesomeachievements.Wehasobtainedsomedifferenttypesofrec
