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《蓖麻蠶孵化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、學(xué)校代碼：10289分類號：S8密級：公開學(xué)號：122310018江蘇科技大學(xué)碩士學(xué)位論文蓖麻蠶孵化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建研究生姓名賀華導(dǎo)師姓名唐順明申請學(xué)位類別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)位授予單位江蘇科技大學(xué)學(xué)科專業(yè)特種經(jīng)濟動物飼養(yǎng)論文提交日期2015年4月23日研究方向昆蟲分子生物學(xué)論文答辯日期2015年6月3日答辯委員會主席張國政評閱人2015年6月10日分類號：S8密級：公開學(xué)號：122310018江蘇科技大學(xué)碩士學(xué)位論文蓖麻蠶孵化酶基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因載體構(gòu)建學(xué)生姓名賀華指導(dǎo)教師唐順明副研究員江蘇科技大學(xué)二O一五年六月AThesisSubmittedinFulfillme
2、ntoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceMolecularcloningofhatchingenzymegeneinPhilosamiaCynthiariciniandconstructionoftransgenicrecombinantplasmidSubmittedbyHeHuaSupervisedbyTangShunmingJiangsuUniversityofScienceandTechnologyJune,2015江蘇科技大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究
3、工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔。學(xué)位論文作者簽名：年月日江蘇科技大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)江蘇科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：(1)保密□，在年解密后適
4、用本授權(quán)書。(2)不保密□。學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：年月日年月日摘要摘要蓖麻蠶（Philosamiacynthiaricini,eri-silkworm）是室內(nèi)飼養(yǎng)的重要經(jīng)濟昆蟲，以蓖麻葉為主要飼料，屬于鱗翅目大蠶蛾科。包括家蠶、柞蠶、野蠶、桑蟥及小菜蛾在內(nèi)幾種鱗翅目昆蟲孵化酶基因cDNA業(yè)已克隆報道，本文我們對蓖麻蠶孵化酶基因進行研究。根據(jù)已報道鱗翅目昆蟲孵化酶的基因保守序列，我們設(shè)計合成兼并性引物，以蓖麻蠶轉(zhuǎn)青卵cDNA為模版，克隆獲得部分蓖麻蠶孵化酶基因（PhilosamiaCynthiaricinihatchingenzyme,PcrHE）序列，然后通過RA
5、CE-PCR和序列拼接獲得蓖麻蠶孵化酶基因全長序列。PcrHE全長cDNA為962bp，其中包含3’UTR、5’UTR和885bp的開放閱讀框，共編碼294個氨基酸，N端16個氨基酸殘基為信號肽序列。序列比對的同源性分析顯示PcrHE與ApHEL，BmandHE，BmHE，RmHE，PxHE，BmHEⅡ，CuefHCE，DmHEHS，MLCE，XHE，EHE12，ZHCE1，MHCE23，TuHE，Aatacin和QHE的蛋白功能區(qū)序列相似性分別為92.3%，84.2%，83.3%，82.4%，79.5%，76.1%，44.7%，43.6%，33.9%，33.7%，32.3
6、%，32.3%，32.1%，31.7%，31.4%和30.8%，根據(jù)進化樹分析顯示蓖麻蠶與柞蠶的親緣關(guān)系最近。根據(jù)同源建模的方法對PcrHE進行了三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測，顯示其與蝲蛄金屬蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)相似，利用PROCHECK對所建蛋白三維結(jié)構(gòu)進行了評價，模擬得到的PcrHE蛋白三維結(jié)構(gòu)有90.2%位于合理區(qū)域內(nèi)，理論上表明蛋白三維結(jié)構(gòu)是可靠的。通過RT-PCR的方法我們發(fā)現(xiàn)，在蓖麻蠶卵胚胎發(fā)育期不同階段中，可以在胚胎發(fā)育早期檢測到PcrHE轉(zhuǎn)錄本，維持在較低水平，孵化時達到最高值，表明PcrHE可能與孵化過程相關(guān)。另外，PcrHE轉(zhuǎn)錄本可在幼蟲的中腸和精巢中檢測到，推測PcrH
7、E可能還有食物消化、精子發(fā)生等其它生物學(xué)功能。我們將PcrHE的成熟酶序列、去信號肽序列、ORF序列對應(yīng)的基因序列分別克隆到原核表達系統(tǒng)pET28a中進行蛋白原核表達，SDS-PAGE電泳檢測蛋白的表達，并用WesternBlot進行驗證。最后我們克隆了家蠶孵化酶基因啟動子（BmHEⅠp，BmHEⅡp），由其驅(qū)動蓖麻蠶孵化酶基因，分別構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因重組質(zhì)粒pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅠp-PcrHE，pSL-3XP3-EGFP/BmHEⅡp-PcrHE，并嘗試將其用顯微注射方法導(dǎo)入到家蠶卵中，以期在個體水平驗
