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1、Klotho對(duì)缺血再灌注急性腎損傷中細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究EffectofKlothoonAutophagyInducedInRenalIschemia/ReperfusionInjuryandItsMechanism研究生姓名關(guān)雪晶指導(dǎo)教師嚴(yán)玉澄教授學(xué)科（專業(yè)）內(nèi)科學(xué)（腎臟病）答辯日期2015年4月Klotho對(duì)缺血再灌注急性腎損傷中細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究EffectofKlothoonAutophagyInducedInRenalIschemia/ReperfusionInjuryandIt
2、sMechanism學(xué)科專業(yè)內(nèi)科學(xué)（腎臟病）研究生姓名關(guān)雪晶指導(dǎo)教師嚴(yán)玉澄教授指導(dǎo)小組顧樂(lè)怡、張敏芳、龐慧華、林星輝申請(qǐng)學(xué)位博士學(xué)位學(xué)號(hào)0127219142答辯日期2015年4月研究方向急性腎損傷的防治與研究關(guān)鍵詞急性腎損傷，自噬，Klotho，細(xì)胞凋亡，缺血再灌注，機(jī)制資助基金國(guó)家自然科學(xué)基金（81170687，81470918）上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項(xiàng)目（134119a2300）培養(yǎng)單位上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文Klotho對(duì)缺
3、血再灌注急性腎損傷中細(xì)胞自噬的作用及其機(jī)制研究摘要第一部分缺血再灌注急性腎損傷中自噬的動(dòng)態(tài)改變及與腎損傷的關(guān)系目的：體內(nèi)外觀察自噬與凋亡在缺血再灌注急性腎損傷（acutekidneyinjury，AKI）中的動(dòng)態(tài)改變，探討AKI過(guò)程中自噬與凋亡的關(guān)系。方法：80只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，n=40）和腎臟缺血再灌注組（ischemia/reperfusion組,I/R，n=40），采用雙側(cè)腎蒂夾閉法建立缺血再灌注模型，于再灌注后0h、2h、5h、12h、1d、2d、3d和7d收集小
4、鼠的血液及腎組織；體外培養(yǎng)腎小管細(xì)胞（TCMK-1）隨機(jī)分為常氧組（Normoxic，Nor組）、低氧組（Hypoxia，H6h，H12h，H24h組）和低氧/復(fù)氧組（Hypoxia/Reoxygenation，H/R2h，H/R4h，H/R8h，H/R24h組），檢測(cè)小鼠腎功能；HE染色觀察腎組織損傷情況；Annexin-V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性；Westernblotting檢測(cè)腎組織和細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)情況，電鏡觀察腎
5、組織和細(xì)胞的自噬體結(jié)構(gòu)。結(jié)果：1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：與Sham組相比，I/R2h腎組織自噬表達(dá)開(kāi)始升高（p<0.05），表現(xiàn)為L(zhǎng)C3-II/LC3-I的比值增高及p62蛋白表達(dá)的下降；第2d自噬水平最高（p<0.001），至第3d自噬開(kāi)始下降但仍高于Sham組（p<0.05），第7d自噬降至正常水平，電鏡下缺血再灌注第1d腎組織內(nèi)出現(xiàn)吞噬了損傷線粒體和胞漿成分的自噬體結(jié)構(gòu)；相比而言I/R后腎組織凋亡出現(xiàn)較晚，在I/R12h時(shí)腎組織Bcl-2/Bax比值開(kāi)始下降，明顯低于Sham組（p<0.01），第1d時(shí)凋亡最
6、明顯（p<0.001），隨再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)腎組織凋亡逐漸減輕，至第3dBcl-2/Bax比值上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文已恢復(fù)至正常；血Scr和BUN分別在再灌注2h和5h開(kāi)始上升，至第1d達(dá)峰值(Scr:130.00±30.07umol/Lvs14.00±6.60umol/L，BUN:45.57±8.67mmol/Lvs8.18±2.17mmol/L；p值均<0.001)，隨后開(kāi)始降低，分別在術(shù)后第7d和第2d恢復(fù)正常；HE染色顯示再灌注第1d近端小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)了相應(yīng)的組織學(xué)損傷表現(xiàn)，至第7d腎組織損傷
7、明顯減輕；2、體外實(shí)驗(yàn)?zāi)I小管細(xì)胞低氧刺激12h后腎小管細(xì)胞自噬開(kāi)始上調(diào)（p<0.05），延長(zhǎng)低氧至24h自噬進(jìn)一步升高（p<0.001），細(xì)胞復(fù)氧4h、8h自噬水平開(kāi)始下降但仍高于常氧組（p<0.05），電鏡下復(fù)氧4h腎小管細(xì)胞內(nèi)大量自噬體吞噬胞漿成分，復(fù)氧24h自噬降至正常水平；而細(xì)胞低氧刺激24h凋亡才開(kāi)始出現(xiàn)，且復(fù)氧4h、8h后Bcl-2/Bax比值較單純低氧24h組下降更明顯（p<0.05），至復(fù)氧24h仍未恢復(fù)正常（p<0.001）；流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)低氧刺激24h后細(xì)胞凋亡開(kāi)始
8、增多，細(xì)胞活性開(kāi)始下降（p<0.05），復(fù)氧4h、8h凋亡細(xì)胞進(jìn)一步增加，細(xì)胞活性也進(jìn)一步下降，直至復(fù)氧24h細(xì)胞凋亡、活性仍未恢復(fù)正常。結(jié)論：缺血再灌注AKI損傷早期，自噬升高早于凋亡，而在AKI恢復(fù)期，自噬的下降晚于凋亡，自噬可能作為一種損傷適應(yīng)性反應(yīng)在AKI早期延緩凋亡的發(fā)生，在AKI恢復(fù)期促進(jìn)腎組織的修復(fù)。第二部分調(diào)節(jié)自噬表達(dá)在缺血再灌注急性腎損傷中的作用及作用機(jī)制目的：觀察自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，
