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1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）論文題目鐵皮石斛4CL基因的克隆與序列分析姓名張新玉學(xué)號(hào)10197016學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)生物技術(shù)指導(dǎo)教師樊洪泓職稱副教授中國(guó)·合肥二零一四年五月目錄中文摘要1關(guān)鍵詞11.材料與方法21.1試驗(yàn)材料21.2試驗(yàn)試劑21.3試驗(yàn)方法21.3.1鐵皮石斛總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成21.3.2引物設(shè)計(jì)21.3.3鐵皮石斛4CL基因cDNA核心片斷的獲得21.3.45'RACE和3'RACE擴(kuò)增21.3.5鐵皮石斛4CL基因全長(zhǎng)cDNA的克隆31.3.6序列分析32.結(jié)果與分析32.1鐵皮石斛總RNA提取質(zhì)量的檢測(cè)32.2鐵皮石
2、斛4CL基因核心片段的克隆與鑒定32.3鐵皮石斛4CL基因的RACE擴(kuò)增與序列鑒定42.4鐵皮石斛4CL基因全長(zhǎng)cDNA的克隆與鑒定52.5氨基酸序列序列比對(duì)和進(jìn)化分析53.討論7參考文獻(xiàn)8Abstract9Keywords9致謝9鐵皮石斛4CL基因的克隆與序列分析作者：張新玉指導(dǎo)老師：樊洪泓（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2010級(jí)生物類創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)班，合肥230036）摘要：本試驗(yàn)采用同源擴(kuò)增技術(shù)和cDNA末端快速擴(kuò)增（rapidamplificationofcDNAendsRACE）技術(shù)對(duì)鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）中的4-香豆酸：輔酶A連
3、接酶（4-Coumarate:CoenzymeALigase4CL）基因進(jìn)行克隆。根據(jù)基因的保守性，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他植物的4-香豆酸：輔酶A連接酶的氨基酸保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)為1650bp，編碼549個(gè)氨基酸，具有4CL基因家族的特異序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，4CL的氨基酸序列進(jìn)化方向與植物基本保持一致，符合從低等到高等、從簡(jiǎn)單到復(fù)雜的演變過程。對(duì)鐵皮石斛4CL基因的克隆，為進(jìn)一步研究4CL基因參與的植物次生代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；4-香豆酸：輔酶A連接酶（4CL）；基因克隆鐵皮石斛（Dendrobiumoffic
4、inaleKimuraetMigo）為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，因表皮呈鐵綠色而得名。按形態(tài)、產(chǎn)地等分類，石斛屬植物可分為鐵皮、金釵、霍山、黃草、環(huán)草、馬鞭等數(shù)十個(gè)品種，其中以鐵皮石斛最為珍貴。研究表明鐵皮石斛具有生津養(yǎng)胃、滋陰清熱、護(hù)肝利膽、明目強(qiáng)腰的功效，此外還具有抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗氧化衰老等療效。在植物界，鐵皮石斛素有“軟黃金”“千金草”之盛譽(yù)，是民間傳說中的“救命仙草”，國(guó)際上稱其為“藥界大熊貓”。野生鐵皮石斛多生于海拔100~3000m之間的山地半陰巖石或樹皮上，喜溫暖濕潤(rùn)氣候和半陰濕的環(huán)境，不耐寒[1]。由于它生長(zhǎng)及繁殖條件十分
5、苛刻，自然產(chǎn)量極為稀少，更因環(huán)境破壞，過度采挖，致使野生資源瀕臨絕種。研究鐵皮石斛的代謝途徑與調(diào)控，有助于更好地開發(fā)利用鐵皮石斛的市場(chǎng)價(jià)值。苯丙烷類化合物生物代謝途徑是一條與碳循環(huán)有關(guān)的最主要的次生代謝途徑之一。在植物中，該途徑的各種分支途徑可以產(chǎn)生許多天然產(chǎn)物如黃酮、類黃酮、木質(zhì)素、色素、芪類、酚酸類化合物等[2]。作為該代謝途徑中關(guān)鍵限速酶之一的4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-Coumarate:CoenzymeALigase4CL），控制著苯丙烷類化合物代謝途徑向不同的方向進(jìn)行，處在總途徑向各分支途徑的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。前人的研究結(jié)果表明，4CL基因在植物與環(huán)境的相
6、互作用中也起著重要作用。經(jīng)研究證實(shí)，除了多糖外，鐵皮石斛中的酮類、芪類物質(zhì)也具有重要的藥理活性，如β-紫羅蘭酮具有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用[3]；芪類化合物是一種抗菌的植物抗毒素，具抑菌抗氧化抗腫瘤等多種生物活性[4]，LiYan等[5,6]曾從鐵皮石斛莖中分離得到27個(gè)芪類及其衍生物。因此，研究鐵皮石斛中的4CL基因，對(duì)解析鐵皮石斛次生物質(zhì)代謝調(diào)控及人類健康事業(yè)具有重要意義。本文主要研究鐵皮石斛4CL基因的克隆及其序列分析。以鐵皮石斛為實(shí)驗(yàn)材料，參考其它植物4CL基因的序列，利用DNAstar軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，克隆鐵皮石斛4CL基因cDNA片段，利用RACE(ra
7、pidamplificationofcDNAends)技術(shù)獲得該基因的3’和5’末端序列，進(jìn)而獲得該基因的全長(zhǎng)cDNA。同時(shí)利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)和Blast軟件等對(duì)所得序列進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究4-香豆酸：CoA連接酶在石斛次生代謝途徑中的作用提供理論依據(jù)。91.材料與方法1.1試驗(yàn)材料鐵皮石斛莖葉，取自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。1.2試驗(yàn)試劑RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司），Taq酶、PMD18-Tvector、dNTPs和RACEcDNAAmplificationKit（均購(gòu)自TAKARA公司），EscherichiacoliDH5α（由實(shí)驗(yàn)室
8、制取培養(yǎng)），柱式膠回收純化試劑盒（上海
