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《hbsag免疫對小鼠 t、b細胞功能的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、系統(tǒng)實驗之二T淋巴細胞功能測定付海英fuhaiying612@yahoo.com.cn實驗流程1W1.雙向免疫擴散試驗③2.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)④OVA(1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔內(nèi)注射500μlOVA+CFA加強免疫小鼠500μl①摘眼球取血無菌取脾和胸腺②分離血清②2W取脾和胸腺②淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗②生理鹽水（500μl)免疫小鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水加強免疫小鼠500μl①2WAfter1W對照組實驗組抗體效價增殖功能實驗內(nèi)容小鼠摘眼球取血、分離血清淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗教學(xué)要求掌握小鼠血清的分離掌握淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗的基本原理及基本操
2、作淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 (Lymphocytetransformationtest)原理檢測方法操作步驟應(yīng)用實驗分組及材料器材酒精棉球若干無菌紗布塊1塊/組無菌平皿1塊/組無菌吸頭（大、中、?。?盒/room無菌96孔培養(yǎng)板1塊/組可調(diào)微量加樣器4套/room細胞計數(shù)板1套/組顯微鏡1臺/組EP管若干眼科剪、小鑷子4套/room細胞培養(yǎng)箱（37℃5%CO2)酶標儀離心機2個/room超凈臺2個/room動物及試劑小鼠2只/組(NS,OVA)培養(yǎng)液（IMDM)無FCS100ml/room培養(yǎng)液（IMDM)20%FCS30ml/roomConA（2.5,
3、5,10μg/ml)各1.5ml/tube白細胞計數(shù)液（2%冰醋酸）2瓶/roomMTT（5mg/ml)1.5ml/room二甲亞砜（DMSO)5ml/組分組：每組四人，兩人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾臟免疫血清分離過程摘眼球取血RTfor2hrsRotation3000rpmfor20minTransferserumtoanewEPDoublediffusionStoreat4℃ELISA1.5mlEP實驗步驟單細胞懸液的制備：小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超凈臺內(nèi)取出脾和胸腺組織(各1/2)，分別放入預(yù)先盛有2mlIMDM培養(yǎng)液的
4、平皿內(nèi)。將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕壓組織，將其搗碎。然后用1000μl加樣器隔著紗布將細胞懸液吸出，放入1.5mlEP管中。細胞計數(shù)：取上述制備好的細胞懸液混勻后取出20μl，加到盛有980μl計數(shù)液的EP管中，在顯微鏡下計數(shù)，計數(shù)方法見后。調(diào)細胞濃度至1×107/ml，所需量為1.5ml，設(shè)需要的細胞懸液體積為Aml,可按公式：?/ml×A=1.5×1×107NOTE:在稀釋前一定將原細胞懸液混勻，否則細胞長時間沉淀使細胞數(shù)不準。細胞計數(shù)板查出四個大方格的總細胞數(shù)(X)算出每個大方格的細胞數(shù)：Y=X/4每個大方
5、格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細胞懸液的細胞濃度（/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)(50)4細胞培養(yǎng)：按圖所示加板。將板做好標記，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后放于37℃5%C02培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)48小時。MTT摻入：（隔一天下午2:00）在終止培養(yǎng)前2小時，在顯微鏡下觀察細胞轉(zhuǎn)化情況。每孔內(nèi)加入MTT（5mg/ml)10μl，加完后輕輕搕板，使MTT和細胞混勻。在37℃5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2小時，然后離心2000rpm，5min，輕輕棄去上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。加入100μl二甲亞砜（
6、DMSO)，將顆粒溶解。（隔一天下午4:00）結(jié)果測定：結(jié)果測量：用酶標儀測定光密度值：A570nm（用空白孔調(diào)零），記錄結(jié)果。結(jié)果判定：SI（刺激指數(shù)）=ConA刺激孔A值/對照孔A值預(yù)習(xí)內(nèi)容單克隆抗體的制備（理論P70，實驗P106）雙向免疫擴散（理論P241，實驗P116）八個人一塊培養(yǎng)板，兩人加脾，兩人加胸腺每孔加入100μl調(diào)好的細胞懸液1-3孔加入10%FCS-IMDM培養(yǎng)液，100μl4-6孔加入2.5μg/ml的ConA,100μl7-9孔加入5μg/ml的ConA,100μl10-12孔加入10μg/ml的ConA,100μlN
7、OTE:ConA用10%FCS-IMDM培養(yǎng)液配制1-34-67-910-12Aspleencell+10%IMDMspleencell+ConA2.5μg/mlspleencell+ConA5μg/mlspleenCell+ConA10μg/mlBspleencell+10%IMDMspleencell+ConA2.5μg/mlspleencell+ConA5μg/mlspleenCell+ConA10μg/mlCthymuscell+10%IMDMthymuscell+ConA2.5μg/mlthymuscell+ConA5μg/mlthym
8、usCell+ConA10μg/mlDthymuscell+10%IMDMthymuscell+ConA2.5μg/mlthymusce
